Nádory pod drobnohledem aneb co (ne)víte o extracelulárních vezikulech?
„Určitá kontroverze spojená s extracelulárními vezikuly je dána mimo jiné trochu překotným vývojem v oboru. Řada lidí měla příliš vysoká očekávání, která se opírala o v minulosti nepříliš standardizované experimenty. Proto se nyní snažíme o lepší praxi ve výzkumu, která je nutná nejen pro kredit oboru, ale i pro přenesení příslibů extracelulárních vezikulů do klinické praxe. Můžeme je například upravit tak, aby nesly specifické molekuly, jako jsou cytostatika či terapeutické miRNA, a efektivně je dopravily do cílových buněk. Tento přístup otevírá dveře pro další možnosti cílené terapie,“ říká prezidentka nedávno vzniklé České společnosti pro extracelulární vezikuly RNDr. Vendula Hlaváčková Pospíchalová, Ph.D., z Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity a Národního ústavu pro výzkum rakoviny.
Jak úvodem připomíná V. Hlaváčková Pospíchalová, extracelulární vezikuly (EV) jsou malé membránové váčky, které hrají významnou roli v mezibuněčné komunikaci. Uvolňovány jsou pravděpodobně všemi typy buněk a obsahují různé druhy bioaktivních molekul, které ovlivňují chování a funkci ostatních buněk. Může jít o lipidy (např. fosfolipidy, cholesterol), proteiny (např. různé typy membránových proteinů, enzymů, receptory, signalizační molekuly), nukleové kyseliny (např. DNA, RNA, mikroRNA), sacharidy a jiné metabolity.
Zrcadlo pro mateřské buňky
„Extracelulární vezikuly tak vynikají schopností přenášet informace, signály a materiál mezi buňkami na různé vzdálenosti – to znamená lokálně, v rámci tkání, systémově i mezi generacemi. Současně se účastní naprosté většiny fyziologických i patologických procesů, včetně imunitní odpovědi, regenerace tkání, nádorového bujení, komunikace mezi matkou a plodem a mnoha dalších,“ vysvětluje s tím, že z klinického hlediska je nejdůležitějším faktem, že EV mohou prostřednictvím svého komplexního složení odrážet identitu a aktuální stav buňky, ze které vznikly, a ovlivňovat funkce a fenotypy buněk ostatních. Tyto vlastnosti naznačují silný biomarkerový a terapeutický příslib, což vyvolává široký zájem o studium EV.
„A protože extracelulární vezikuly cirkulují v tělních tekutinách, ze kterých mohou být získány i zcela neinvazivně, mají velký potenciál jako nosiče biomarkerů. Klíčové je, že můžeme extracelulární vezikuly upravit tak, aby nesly specifické molekuly, jako jsou např. cytostatika nebo terapeutické miRNA, a efektivně je dopravily do cílových buněk. Tento přístup otevírá dveře pro možnosti cílené terapie, kde lze využít přirozený transportní mechanismus extracelulárních vezikulů k doručení terapeutických molekul přímo na místo potřeby. Tím lze maximalizovat účinek léčby a minimalizovat nežádoucí účinky na normální tkáně,“ zdůrazňuje V. Hlaváčková Pospíchalová.
Exozomy, ektozomy, nebo něco jiného?
Existuje přitom mnoho různých typů EV, které byly navíc historicky pojmenovávány různě. „Podle současných směrnic v oboru, známých jako MISEV2023, označuje termín ‚extracelulární vezikuly‘ částice uvolňované z buněk, které jsou ohraničeny lipidovou dvojvrstvou a nejsou schopny se samy replikovat. Jinými slovy, neobsahují funkční jádro,“ upřesňuje RNDr. Hlaváčková Pospíchalová. Dodává k tomu, že International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) doporučuje používat obecný termín „extracelulární vezikuly“, případně jeho operační rozšíření (např. malé EV, CD63+ EV), namísto nekonzistentně definovaných a někdy zavádějících termínů, jako jsou „exozomy“ a „ektozomy“, které jsou spojeny s cestami biogeneze a ex post je obtížné je stanovit.
„Vůbec nejvíce je v odborné veřejnosti zakořeněn termín exozomy, odkazující na extracelulární vezikuly, které mají endozomální původ. Vznikají ve specializovaném typu pozdních endozomů, tzv. multivezikulárních tělískách. Termín ektozomy, někdy taktéž mikrovezikuly či mikropartikule, pak odkazuje na extracelulární vezikuly vznikající odštěpením z cytoplazmatické membrány,“ konstatuje V. Hlaváčková Pospíchalová.
EV jako diagnostické, prognostické i prediktivní markery
Jak dále uvádí, produkce EV představuje komplexní proces ovlivněný mnoha faktory, např. hypoxií či infekcí. Odlišné typy buněk mají navíc rozdílnou kapacitu k produkci konkrétních typů EV v závislosti na svém stavu a funkci. Změny v množství a složení EV tak mohou být spojeny s určitými onemocněními, mimo jiné neurodegenerativními nebo nádorovými.
„Již delší dobu je známo, že nádorové mikroprostředí, zahrnující okolní tkáň, cévy, imunitní buňky a další složky, jež ho obklopují, výrazně ovlivňuje chování tumoru, a především jeho odpověď na léčbu. Studium extracelulárních vezikulů, které jsou nedílnou součástí tohoto mikroprostředí, proto přináší hlubší porozumění interakcím mezi nádorem a jeho okolím a možnost najít způsoby, jak tyto interakce ovlivnit nebo je využít v léčbě,“ podotýká RNDr. Hlaváčková Pospíchalová. Porozumění mikroprostředí nádoru je tudíž klíčové pro vývoj efektivnějších léčebných strategií a zlepšení prognózy pacientů.
„Analyzováním obsahu extracelulárních vezikulů můžeme odhalit specifické molekulární signatury spojené s určitými typy nádorů nebo fázemi onemocnění. Tyto biomarkery mohou sloužit jako diagnostické nástroje pro detekci malignit v raných stadiích, ale také jako prognostické indikátory pro předpověď průběhu onemocnění a prediktivní faktory pro určení účinnosti terapie. Tato identifikace specifických markerů spojených s odpovědí na léčbu může umožnit personalizovaný přístup a racionální výběr léčiv,“ upozorňuje V. Hlaváčková Pospíchalová.
Studium EV může rovněž vést k identifikaci nových terapeutických cílů, protože EV mohou nést různé biomolekuly a signály klíčové pro nádorový růst, invazi a metastazování. „Příkladem je jejich podíl na tvorbě tzv. premetastatické niky, specifického mikroprostředí v cílových orgánech, které je připraveno přijmout metastatické buňky. Tyto niky pro budoucí sekundární nádory jsou vytvářeny před příchodem metastatických buněk a jsou ovlivněny signály obsaženými v extracelulárních vezikulech uvolňovaných primárním nádorem a jeho mikroprostředím,“ naznačuje a shrnuje, že integrace poznatků z výzkumu EV do klinické praxe může významně zlepšit diagnostiku, léčbu a monitorování různých typů nádorových a dalších onemocnění.
Univerzální metoda pro charakterizaci EV neexistuje…
A nakolik je vlastně získání EV z tělních tekutin složité a jakými metodami je možné je studovat? Jak vysvětluje RNDr. Hlaváčková Pospíchalová, díky své dvojité membráně jsou EV stabilní v mimobuněčném prostředí a cirkulují ve všech tělních tekutinách; zároveň jsou velmi malé (desítky až stovky nanometrů) a heterogenní, což vyžaduje specializované přístupy. Jejich získání z tělních tekutin komplikuje přítomnost tzv. non‑vezikulárních extracelulárních částic (NVEP), které jsou tvořeny buněčnými komponentami, ale nevytvářejí dvojitou membránu jako EV. Typickým příkladem jsou lipoproteinové částice, ribonukleoproteinové částice nebo recentně popsané exomery a supermery. Počet NVEP v biologických tekutinách výrazně – i o několik řádů – převyšuje počet EV, které je proto obvykle nutné izolovat, nebo alespoň nabohatit. „Naneštěstí mají non‑vezikulární extracelulární částice a extracelulární vezikuly překrývající se fyzikálně‑chemické vlastnosti, takže většina metod vede k jejich společnému získání,“ naznačuje.
Izolaci EV lze provést např. na základě hustoty (ultracentrifugace s hustotním gradientem), velikosti (velikostní filtrace/chromatografie), náboje (precipitace polymery) či povrchových molekul (imunomagnetická separace). Jednotlivé metody se liší nejen technickou náročností, ale také výtěžností a specificitou pro EV oproti NVEP. Stejně tak mnoho metod nedokáže identifikovat EV specificky – výjimkou je pouze kryo‑elektronová mikroskopie, která umožňuje vizualizaci dvojité membrány. Mezi kvantitativní metody patří především „nanoparticle tracking analysis“ (NTA), techniky měřící dynamický rozptyl světla (DLS) nebo různé varianty průtokové cytometrie. Ta dovoluje i analýzu obsahu EV, stejně jako metody typu hmotnostní spektrometrie, western blot či analýza nukleových kyselin (PCR, microarraye, sekvenování aj.).
„Žádná univerzální metoda pro izolaci a charakterizaci extracelulárních vezikulů tedy bohužel neexistuje, její výběr přitom závisí na konkrétních cílech studia. Nicméně pro klinickou praxi jsou asi nejzajímavější techniky, které nevyžadují izolaci extracelulárních vezikulů, ale rovnou dovolují charakterizovat jejich obsah, jako jsou různé mikrofluidní čipy a podobně,“ dodává RNDr. Hlaváčková Pospíchalová.
… poradit může nově vzniklá odborná společnost
Jak přiznává, EV ji osobně fascinují hned z několika důvodů. „Za prvé se jedná o malé struktury s obrovským potenciálem. Za druhé je pro mě zajímavá interdisciplinární povaha jejich studia a také rychlý metodologický vývoj, ke kterému jsme naší prací snad také přispěli. Lákavá je pak i určitá kontroverze spojená s extracelulárními vezikuly, která je dána mimo jiné trochu překotným vývojem v oboru. Řada lidí měla příliš vysoká očekávání, která se opírala o v minulosti nepříliš standardizované experimenty. Proto se nyní snažíme o lepší praxi ve výzkumu, která je nutná nejen pro kredit oboru, ale i pro přenesení příslibů extracelulárních vezikulů do klinické praxe,“ upozorňuje s tím, že výzkum v oblasti EV se v Česku rychle rozvíjí a zajímá se o něj stále více nadšených badatelů. Nejde však pouze o výzkum onkologický, ale např. i výzkum bakteriálních a rostlinných EV, interakcí patogenů EV s imunitním systémem hostitele, EV nanotechnologií, EV jako nosičů léčiv či o vývoj pokročilých zobrazovacích metod.
Letos v březnu přitom byla oficiálně založena Česká společnost pro extracelulární vezikuly (CzeSEV), která čítá již téměř 50 členů a dá se předpokládat, že další budou přibývat. „O jejím založení jsme s kolegy uvažovali již několik let, ale rozhodujícím impulsem byla absence národní organizace, která by nás zastřešila a umožnila nám účastnit se mobilitního programu MOVE – Mobility for Vesicles Research in Europe. Rostoucí zájem o extracelulární vezikuly nás také motivoval k vytvoření platformy pro podporu výzkumu, výměnu znalostí a sdílení specializovaných přístrojů mezi členy české vědecké obce,“ vysvětluje V. Hlaváčková Pospíchalová, podle níž je hlavním posláním CzeSEV usnadnit spojení, podporovat spolupráci a budovat mosty mezi výzkumníky v této oblasti – jak v tuzemské, tak v globální komunitě. Společnost zároveň organizuje odborná setkání, workshopy a konferenci. Spolupráce s ISEV jí navíc umožňuje přispívat k mezinárodnímu pokroku ve výzkumu EV a aktivně propagovat jeho současné standardy. Ty jsou shrnuty ve směrnici MISEV2023, na jejímž se vzniku se podílelo 1 051 autorů z 53 zemí, mezi nimi i pět z ČR (všichni jsou členy CzeSEV), a měl by si ji nastudovat každý, kdo má zájem provádět relevantní výzkum EV.
„Těší mě, že CzeSEV byla okamžitě a velmi vřele přijata do rodiny národních společností – Global EV network. Mezi naše nejbližší partnery patří německá a především rakouská společnost, jež nám nabídla společnou konferenci ASEV‑CzeSEV v září tohoto roku ve Vídni. Je to pro nás velká výzva a současně jedinečná příležitost, která může být prvním krokem k větší konkurenceschopnosti českého výzkumu extracelulárních vezikulů v mezinárodním měřítku,“ říká RNDr. Hlaváčková Pospíchalová a dodává, že snahou CzeSEV je taktéž popularizace tohoto tématu nejen u odborné, ale i laické veřejnosti.
„Z domácí komunity se na nás většinou obracejí kolegové, kteří s extracelulárními vezikuly teprve začínají a hledají rady, jak ke svým otázkám metodicky přistoupit. Opravdu totiž není lehké se v této oblasti rychle a správně zorientovat,“ konstatuje s tím, že o EV proto cíleně přednášejí i v rámci výuky studentů. „Toto téma je natolik nové, že se prozatím nedostalo do světových učebnic molekulární a buněčné biologie, jako jsou Alberts nebo Lodish.“
Zaměřeno (nejen) na karcinomy vaječníků
A co pro podporu této vědecké komunity znamená vznik a rozvoj Národního ústavu pro výzkum rakoviny (NÚVR), jehož součástí je i tým okolo Venduly Pospíchalové Hlaváčkové? „Domnívám se, že NÚVR má několik významných výhod a přínosů. Za nejdůležitější považuji podporu a koordinaci interdisciplinární spolupráce mezi výzkumnými týmy v ČR, včetně lepšího využití infrastruktur, a jakési zastřešení a mezinárodní reprezentaci tuzemského základního, aplikovaného a translačního onkologického výzkumu,“ konstatuje s tím, že NÚVR je zároveň v mnoha aspektech inspirací pro CzeSEV. „Máme několik podobných cílů v oblasti extracelulárních vezikulů, i když samozřejmě v mnohem menším a značně méně pokročilém měřítku.“
Jak závěrem zdůrazňuje V. Hlaváčková Pospíchalová, výzkum EV má potenciál přinést zásadní poznatky do mnoha oblastí medicíny. „Rádi proto pomůžeme s jejich studiem formou spolupráce, což se ostatně děje již u nádorů prostaty či pankreatu a nově i u neurodegenerativních a jednoho chronického onemocnění,“ naznačuje a dodává: „Můj výzkumný tým se nicméně zaměřuje na ovariální karcinom, kde je naší hlavní prioritou studium ascitických extracelulárních vezikulů. Do patologického výpotku v dutině břišní, který se právě u pacientek s tímto karcinomem často vyskytuje, jsou extracelulární vezikuly produkovány nejen nádorovými buňkami, ale i buňkami nádorového stromatu a imunitního systému. Tato vzájemná komunikace ovlivňuje nádorový růst, invazi, metastazování i rezistenci vůči léčbě. S ohledem na množství nezodpovězených otázek v této oblasti prozatím nemáme v plánu měnit naše výzkumné zaměření na jiný typ nádoru.“
K věci
V NÚVR posouvají vpřed poznání nádorového mikroprostředí ovariálního karcinomu
RNDr. Vendula Hlaváčková Pospíchalová, Ph.D., z Přírodovědecké fakulty MU a brněnského uzlu NÚVR a její spolupracovníci izolovali extracelulární vezikuly (EV) z ascitu a identifikovali v nich podskupinu proteinů unikátních pro ascites žen s high‑grade serózním karcinomem (HGSC) vaječníků. Proteomická analýza EV umožňuje hlubší vhled do nádorového mikroprostředí ovariálních karcinomů, a otevírá tak mimo jiné cestu k jejich lepší diagnostice.
V březnu letošního roku byly v Journal of Extracellular Vesicles publikovány výsledky recentní studie (Anna Vyhlídalová Kotrbová, Kristína Gömöryová et al.), ze kterých vyplývá, že analýza proteinů asociovaných s EV získanými z ascitu pacientek s ovariálním HGSC umožňuje predikovat chování nádoru a určit prognózu onemocnění.
V úvodu publikace se připomíná, že ovariální karcinom je podle statistik osmým nejčastějším zhoubným nádorem u žen. Přestože mezi gynekologickými nádory zaujímá svým výskytem až třetí místo, má z nich ze všech nejvyšší úmrtnost. Za 70 procent těchto úmrtí je zodpovědná nejčastější forma ovariálních karcinomů – HGSC vaječníků, vejcovodů a pobřišnice. Časná stadia bývají asymptomatická, ale onemocnění rychle progreduje, takže bývá zpravidla diagnostikováno až v pozdějších stadiích III–IV s přítomností metastáz. Druhým problémem je, že i když pacientka zareaguje na debulkingový chirurgický výkon a chemoterapii, v důsledku získané chemorezistence dochází záhy k relapsu onemocnění. I proto zůstává pětileté přežití ovariálního HGSC nízké, cca 30 procent.
Na rozdíl od jiných nádorových onemocnění, která využívají ke svému metastatickému šíření hematopoetickou cestu, se ovariální HGSC přednostně šíří cestou implantační, při které se nádorové buňky uvolňují z povrchu postižených vaječníků a vejcovodů a usazují se v jiných částech břišní dutiny, jako jsou pobřišnice, omentum a pánevní orgány. Diseminace je často zprostředkována ascitem – výpotkem patologicky akumulovaným v břišní dutině. Ascitická tekutina tak představuje i unikátní zdroj informací o vlastnostech nádoru a jeho mikroprostředí.
Její důležitou komponentou jsou EV, membránové částice, které slouží jako přenašeče proteinů, lipidů a nukleových kyselin mezi buňkami. Podle svého původu se EV dělí na exozomy, ektozomy (dříve označované jako mikrovezikuly) a apoptotická tělíska. Exozomy jsou vezikuly endocytárního původu o velikosti v řádu desítek nanometrů. Vzhledem ke svému endocytickému původu exozomy obsahují proteiny asociované s endozomy, některé z nich se běžně používají jako markery exozomů.
Oproti tomu ektozomy vznikají na povrchu buněk a jejich velikost se může pohybovat od 50 až do 1 000 nm. O obsahu konkrétních proteinů v ektozomech nebyl dlouho dostatek informací.
Kromě proteinů mohou EV obsahovat i nukleové kyseliny, jako je mRNA nebo miRNA, a představují možný zdroj pro identifikaci nových biomarkerů onemocnění nebo molekul zajišťujících mezibuněčnou komunikaci.
EV z ascitů byly izolovány pomocí dvou metod založených na odlišných fyzikálních principech (podle hustoty a podle velikosti částic) a následně byly analyzovány na hmotnostním spektrometru. Jako sada základních proteinů spojených s ascitickými EV byly vybrány ty proteiny, které byly izolovány pomocí obou metod a zároveň nebyly přítomny v tekuté frakci ascitů, jež neobsahuje EV. Tento přístup umožňuje efektivní odfiltrování běžných kontaminantů EV, jako jsou apolipoproteiny, a zároveň zajistí detekci těchto proteinů i při použití komerčních izolačních kolonek pro EV vhodných pro rutinní diagnostiku.
Pro identifikaci proteinů specifických pro HGSC byly použity negativní kontroly (EV z nemaligního ascitu nebo peritoneální tekutiny). Dále byla využita sekvenační data RNA na úrovni jednotlivých buněk z ascitu HGSC, publikovaná v nedávné studii (Izar et al., Nature Medicine 2020), k identifikaci zdrojových buněk ascitických EV. Složení EV totiž odráží typ a stav buňky, ze které vznikly. Překvapivě bylo zjištěno, že ascites obsahuje více EV z buněk nádorového mikroprostředí (fibroblasty a makrofágy) než z maligních buněk, o kterých se předpokládalo, že produkují více EV.
Ve studii se prokázalo, že informace získané analýzou dvou hlavních složek ascitu – ascitických buněk a ascitických EV – se navzájem nepřekrývají, pokud jde o biologické a možná i klinické chování nádoru a jeho mikroprostředí. Autoři se proto zaměřili na otázku, zda obsah některé ze složek ascitické tekutiny může mít prognostickou hodnotu pro celkové přežití pacientek s ovariálním HGSC.
Žádný z buněčných parametrů (maligní buňky, fibroblasty, makrofágy ani buňky periferní krve) v ascitu s přežitím pacientek nekoreloval. Naopak proteomická analýza EV v ascitu vedla k identifikaci těch, jejichž přítomnost přímo souvisela s prognózou onemocnění. Tato práce tak otevírá cestu k budoucí personalizované léčbě pacientek s ovariálním HGSC. red