Čeští vědci vyvinuli nový kultivační model pro studium a testování léčiv u chronické lymfocytární leukémie

„Naše laboratoř se zabývá zkoumáním různých aspektů vlivu mikroprostředí na leukemické buňky již více než deset let. Nedávno jsme publikovali práci popisující inovativní kokultivační model pro napodobení mikroprostředí a indukci dělení buněk chronické lymfocytární leukémie v laboratorních podmínkách, který jako vůbec první umožňuje dosáhnout opravdu dramatické proliferace, cca 50%, a následně studovat molekulární dráhy, které množení řídí. Zároveň můžeme testovat a objevovat nová léčiva cílící na buněčné dělení a rychleji i přesněji hodnotit potenciální léky i jejich kombinace pro terapii tohoto onemocnění,“ říká prof. MUDr. Mgr. Marek Mráz, Ph.D., působící v CEITEC Masarykovy univerzity a ve FN Brno, jehož výzkumná skupina je součástí Národního ústavu pro výzkum rakoviny.

Jak připomíná prof. Mráz, imunitní buňky jsou životně závislé na přítomnosti odpovídajícího mikroprostředí, které se u jednotlivých buněčných typů mění v průběhu jejich vývoje (kostní dřeň vs. periferní krev vs. sekundární lymfatické orgány atd.). V jeho laboratoři se věnují konkrétně studiu chronické lymfocytární leukémie (CLL), což je nejčastější leukémie dospělých, vznikající ze zralých B lymfocytů – tedy buněk, které jsou závislé především na interakcích v mikroprostředí lymfatických uzlin. „V případě CLL se leukemické buňky vyskytují ve vysokém množství v periferní krvi. Množení jsou však schopny právě jen v lymfatických uzlinách, kde jsou vystaveny dvěma klíčovým signálům – za prvé interakcím s T podpůrnými lymfocyty a za druhé stimulaci antigenem,“ dodává s tím, že na svém povrchu mají CLL buňky imunoglobulin, tj. BCR (B-cell receptor).

Mobilizovat CLL buňky z jejich mikroprostředí…

„Není zcela jasné, které signály a interakce jsou pro CLL buňky nejzásadnější, respektive mezi jednotlivými pacienty mohou existovat odlišnosti. Nicméně univerzálně platí, že narušení těchto interakcí tím, že CLL buňky jsou z mikroprostředí mobilizovány, například při použití tzv. BCR inhibitorů, má obrovský léčebný efekt. Bez přítomnosti faktorů z mikroprostředí se totiž leukemické buňky v pacientovi prakticky nejsou schopny množit. CLL je nádorové onemocnění, které je zcela závislé na interakcích v mikroprostředí, což je pro malignity netypické, neboť obecně se domníváme, že vznik a progrese nádorů souvisejí s mutacemi v jejich genomu a mikroprostředí hraje až sekundární roli. U CLL je tomu naopak a primární roli hraje pravděpodobně mikroprostředí,“ vysvětluje prof. Mráz. Dodává přitom, že díky schopnosti mobilizovat CLL buňky z lymfatických uzlin se schválená léčiva z kategorie BCR inhibitorů (ibrutinib, acalabrutinib, zanubrutinib), které cílí na BTK kinázu, staly standardem léčby a iniciálně vedou k odpovědi u více než 90 procent pacientů (ačkoli nejsou kurativní jako samostatná léčba).

Inhibitory BTK byly vyvinuty s cílem blokovat dráhu, která souvisí s rozpoznáním antigenu CLL buňkami pomocí povrchového imunoglobulinu BCR. Deregulaci BCR signalizace využívají leukemické buňky jako jeden z patogenetických mechanismů, neboť tato dráha společně s CLL-T buněčnými interakcemi podporuje proliferaci (je to její fyziologická úloha zajištující schopnost zdravých B lymfocytů vytvářet velká množství protilátek). „Ukázalo se ovšem, že BTK inhibice nejen blokuje očekávaný kanonický proces BCR signalizace, ale interferuje také s migrací buněk v lymfatických niche, a nepřímo tak ‚rozpojí‘ i CLL-T buněčné interakce. CLL buňky vyplavené do periferní krve jsou při podávání BTK inhibitorů zároveň citlivější na další terapeutické zásahy. Velmi účinnou se ukázala kombinace BTK inhibitorů s venetoklaxem, který se váže na protein BCL2 a indukuje apoptózu,“ konstatuje Marek Mráz.

Jeho výzkumnému týmu se dříve taktéž podařilo popsat, proč BTK inhibitory není vhodné kombinovat s anti-CD20 protilátkou rituximabem, což vysvětlily překvapivé negativní výsledky klinické studie (Pavlasova et al., Blood 2016; Sandova et al., Haematologica 2021). Zároveň popsali, jakým způsobem se CLL buňky adaptují na BTK inhibici a jak přežívají v periferní krvi, kam jsou mobilizovány (Seda et al., Blood 2021; Sharma et al., Blood 2021). „Nedávno jsme také získali americký patent na použití nových GAB1 inhibitorů právě v kontextu vzniku rezistence vůči BCR inhibitorům u B buněčných malignit,“ naznačuje prof. Mráz. 

… a simulovat ho v laboratorních podmínkách

Zdůrazňuje dále, že z pohledu zkoumání choroby je velice důležité, že CLL buňky v in vitro podmínkách, které se standardně používají pro kultivaci nádorových buněk, sice přežívají, ale již se nemnoží, protože jim chybějí signály z mikroprostředí, což komplikuje studium procesu, který je zcela zásadní pro vznik a agresivitu leukémie. „Není proto možné provádět pokusy zaměřené na dlouhodobé působení léků ani testovat efekt léčiv, která působí specificky na dělení buněk, ale bez vlivu na viabilitu. Tato léčiva by při kultivaci CLL buněk ve standardních podmínkách byla vyhodnocena jako neúčinná,“ vysvětluje Marek Mráz.

Jeho výzkumný tým však v prestižním časopise Leukemia (Hoferkova et al., 2024) recentně publikoval práci postgraduální studentky Mgr. Evy Hoferkové popisující inovativní kokultivační model podpůrného prostředí pro množení leukemických buněk v laboratorních podmínkách, který umožňuje simulovat interakce v mikroprostředí CLL, a tudíž i studovat procesy, jako jsou CLL proliferace či regulace koncentrací antiapoptických proteinů v CLL buňkách, včetně rodiny BCL2. „Jedná se o model mikroprostředí CLL, v němž jsou leukemické buňky v kontaktu s geneticky upravenou buněčnou linií, kterou jsme pro tento účel připravili. Napodobujeme přitom interakce leukemických buněk s T lymfocyty – a díky tomu se nádorové buňky dělí. Jako vůbec první tento model umožňuje dosáhnout opravdu dramatické proliferace, cca 50%, a následně studovat molekulární dráhy, které množení řídí. Zároveň můžeme testovat a objevovat nová léčiva cílící na buněčné dělení a rychleji i přesněji hodnotit potenciální léky i jejich kombinace, včetně kombinací BTK/BCL2 inhibitorů s jinými léčivy,“ upřesňuje prof. Mráz s tím, že pomocí modelu jeho tým mj. poprvé popsal, že pan-RAF inhibitory velmi efektivně blokují proliferaci CLL buněk. „Tato skupina léčiv nebyla u CLL dříve zvažována, neboť nevedou k usmrcení CLL buněk, a unikly tak pozornosti ve velkých screeningových experimentech cytotoxických látek. Zároveň jsou ale testována u solidních tumorů, takže víme poměrně hodně o jejich bezpečnosti při podání lidem.“

Myší avatar pro testování léků u konkrétního pacienta

Nový model je podle první autorky práce Mgr. Hoferkové rovněž možné přenést do imunodeficientních myší, v nichž se jinak CLL buňky nepřihojí, a potenciálně tak získat zvířata pro individuální testování terapie na nádorových buňkách konkrétního pacienta. Jedná se o tzv. myší avatar.

„Vytvoření individuálních avatarů představuje jednu z možných aplikací, pro niž jsme náš model vyvíjeli. Kromě testování terapie na buňkách darovaných různými pacienty lze využít i leukemické buňky z průběhu terapie, a vzít tak v potaz vliv vznikající rezistence, evoluci mutací a podobně. Kokultivační model je také možné miniaturizovat, to znamená 5 mikrolitrů na jamku, a na malém množství buněk od nemocného testovat velký počet potenciálních léčiv s cílem zjistit, která by u daného jedince byla účinná,“ konstatuje prof. Mráz.

Upozorňuje také, že podpůrné mikroprostředí je významné i pro růst dalších nádorů, třeba indolentních lymfomů. „Náš model poskytující signály z mikroprostředí tak může být vhodný pro výzkum a testování nových léčiv na buňkách například folikulárního lymfomu, případně pro jeho přenos do myšího modelu,“ podotýká Marek Mráz.

Excelentní výzkum vyžaduje stabilní financování

Na přípravě kokultivačního modelu jeho tým primárně spolupracoval s laboratořemi v Brně, následně byl ovšem využit i v rámci cílené spolupráce s výzkumnou skupinou prof. MUDr. Pavla Klenera, Ph.D., která působí na 1. LF UK a je též součástí Národního ústavu pro výzkum rakoviny (NÚVR). „Prakticky paralelně s naší publikací popisující vývoj modelu vyšla i publikace, která jej využívá ve studiu rezistence vůči léčbě u lymfomů,“ dodává Marek Mráz s odkazem na studii Dolnikove et al., zveřejněnou v Blood Advances 2024.

Hlavní benefit NÚVR vidí v potenciálně dlouhodobé podpoře kvalitních týmů a excelentního biomedicínského výzkumu. „Většina našich projektů stojí na dlouholeté a systematické činnosti a k tomu je třeba mít alespoň částečně stabilní financování. Měli jsme to štěstí, že jsme na dobu pěti let získali grant ERC, což nám umožnilo dělat ambiciózní projekty, včetně diskutované publikace v časopisu Leukemia. Nyní po skončení tohoto grantu je pro skupinu důležité, aby nebyla závislá jen na relativně krátkodobém a striktně projektovém financování z národních grantových agentur. Doufejme, že snad dlouhodobá udržitelnost konceptu NÚVR nám dá určitou míru stability a prostor pouštět se do dalších projektů a ještě aktivněji navazovat spolupráce,“ naznačuje prof. Mráz.