Za většinou těžkých epilepsií u dětí stojí de novo mutace genů pro neuronové kanály
„Díky tomu, že dokážeme u velké části pediatrických pacientů se závažnými a časnými epilepsiemi nebo epileptickými encefalopatiemi objasnit etiologii jejich obtíží, můžeme převážnou část rodičů ujistit, že nově vzniklé mutace u jejich dětí jsou jednorázovou chybou a že se nemusejí obávat rizika u svých dalších potomků. Nemocní už nemusejí podstupovat další zbytečná vyšetřování či hospitalizace, v konečném důsledku ani nemusejí absolvovat někdy zbytečně agresivní terapii, která jim nepřinese žádný benefit.“
Cílem projektu prof. Seemana a jeho týmu bylo mimo jiné zjistit, u jakého podílu pacientů v České republice vůbec lze odhalit příčinu výše zmíněných těžkých a geneticky heterogenních onemocnění pomocí masivně paralelního a celoexomového sekvenování. Dále identifikovat, jaké je spektrum kauzálních mutací, v kterých genech a s jakým typem dědičnosti, a podle výsledků navrhnout optimální diagnostický postup pro nelezionální epilepsie nebo epileptické encefalopatie využitelný v běžné praxi, a zlepšit tím zdravotní péči a diagnostiku na úroveň nejvyspělejších zemí.
- Lékařské molekulární genetice v oblasti neurologie se věnujete již dlouhodobě a postupně jste zavedl diagnostiku různých neurologických onemocnění v ČR. Co osobně považujete za největší průlom v této oblasti?
Prvním důležitým krokem bylo, že jsme genetickou diagnostiku neurologických onemocnění vůbec odstartovali – psal se tehdy rok 1997, když jsem na naší klinice začal postupně budovat DNA laboratoř, a trvalo nám několik let, než jsme vědomostmi i vybavením dohnali špičková zahraniční pracoviště. Za podpory grantů jsme začali nejprve s vyšetřováním početné skupiny dědičných neuropatií, nejčastějším geneticky podmíněným neurologickým onemocněním, označovaných jako Charcotova‑Marieova‑Toothova nemoc, které tenkrát v ČR nikdo neposkytoval, a následně se přidaly další geneticky podmíněné nemoci. Například Pelizaeusova‑Merzbacherova choroba patřící mezi leukodystrofie, Nijmegen breakage syndrom spojený s mikrocefalií a vysokým sklonem k malignitám, syndrom CCFDN u Romů a další.
Osobně si ale asi nejvíce cením toho, co jsme dokázali zjistit pro českou populaci v rámci vyšetření pacientů s dědičnou nesyndromovou hluchotou. Tato skupina nemocí je velice rozsáhlá, víme, že každý třicátý člověk je nosičem nejčastější mutace v genu GJB2, což je obdobné jako v případě cystické fibrózy. V současnosti je přitom popsáno okolo 70 genů, jejichž mutace mohou vzácněji podobnou vrozenou hluchotu způsobovat. V naší laboratoři jsme mimo jiné zjistili, že se tato choroba vyskytuje častěji v romské populaci, a to v důsledku stejné mutace, která je častá v Indii, odkud Romové přišli.
- V projektu AZV jste se věnovali objasnění příčin dětských epilepsií a epileptických encefalopatií. Proč jste se zaměřili právě na danou problematiku?
Zejména z toho důvodu, že se jí do té doby u nás nikdo nezabýval, ačkoli to bylo potřeba. Výhodou bylo, že je naše klinika na epileptologii zaměřena a že kolegyně z naší DNA laboratoře už uměly postupy vyšetření z předchozího projektu u Charcotovy‑Marieovy‑Toothovy nemoci. Dětské epilepsie a epileptické encefalopatie představují velmi závažná, geneticky vysoce heterogenní onemocnění bez prevalentní příčiny, která se projevují epileptickými záchvaty brzy po narození – v některých případech jich může být až stovka za den – a způsobují opoždění psychomotorického vývoje nebo jeho zhoršení či útlum, kdy dítě přestane chodit, mluvit a podobně. Obvykle tito pacienti nejsou samostatní a vyžadují celoživotní péči, což pochopitelně vedlo k tomu, že se rodiče obávali, aby jejich další potomci netrpěli stejnou nemocí.
Etiologie těžkých dětských epilepsií zůstávala v minulosti klasickými metodami molekulární genetiky, až na naprosté výjimky, neobjasněná a většinou neznámá. Zavedení moderních genetických technologií, masivně paralelního sekvenování, nazývaného také sekvenování nové generace (NGS), umožnilo objevy mnoha zodpovědných genů. Proto jsme dnes schopni vyšetřovat i geny, jejichž porucha může být důvodem epileptické encefalopatie. Ukazuje se přitom, že u většiny rodičů byly obavy zbytečné, protože hlavní a nejčastější příčinou z těch objasněných případů jsou de novo mutace s dominantním efektem v genech pro iontové kanály mozkových neuronů, které jsou pouze u dítěte. Nejsou tudíž přítomny ani u jeho matky, ani u jeho otce. Je to zkrátka jednorázová chyba při vývoji jedné z pohlavních buněk, někdy spermie, jindy vajíčka. Zjednodušeně tomu říkám „úseky častých nehod“, což jsou místa v genomu náchylnější ke změnám, které zde vznikají opakovaně nebo častěji než jinde.
Naším hlavním úkolem tak bylo zavést do praxe efektivní a ekonomické vyšetření genetických příčin těchto závažných onemocnění, které u nás do té doby nebylo dostupné. A to se podařilo.
- Mohl byste upřesnit, jak moc se tedy nově vzniklé mutace podílejí na vzniku těžkých epilepsií u dětí?
De novo mutace se vyskytují až v 90 procentech objasněných případů, přičemž příčinu obtíží se podaří zjistit u přibližně čtvrtiny z vyšetřených – nejvyšší šance je u dětí se záchvaty velmi brzy po narození. U zbývající zhruba desetiny z objasněných jde o mutace recesivní nebo i vázané na pohlavní X chromozom, tedy zděděné, kdy je zřejmé, že rodiče jsou nosiči, a měli oprávněný strach. Riziko, že druhé dítě bude stejně postižené, je totiž výrazně zvýšené, většinou pětadvacetiprocentní.
- Kolik pacientů a za jakých podmínek bylo do projektu zapojeno?
Pomocí masivně paralelního sekvenování jsme připravili panel 112 genů, o nichž je známo, že jejich poruchy jsou příčinou epilepsií dětského věku, který jsme postupně doplňovali. Nakonec jsme tímto způsobem vyšetřili dohromady 227 pacientů, většinou dětí z našeho motolského Centra pro epilepsie. Pro efektivní diagnostiku bylo klíčové, abychom měli k dispozici dostatek klinických informací a abychom prováděli pečlivý a expertní výběr pacientů zkušenou epileptoložkou. Podmínkou zařazení byla nejen těžká epilepsie bez objasněné etiologie, ideálně s brzkým začátkem záchvatů, ale také normální nález na magnetické rezonanci, to znamená, že musela být vyloučena jiná příčina obtíží. Pacienti měli mít předem i rutinní molekulárně cytogenetické vyšetření metodou array‑CGH, které zachytí chromozomální aberace. A zcela nezbytným kritériem bylo i to, abychom měli k dispozici vzorky DNA od obou rodičů k průkazu, že tu „podezřelou“ mutaci nemá ani jeden z nich. Pokud totiž prokážeme, že jde o de novo mutaci v genu již spojovaném s epilepsií, máme v rukou hodně vážný důkaz, ale není vždy stoprocentní.
- Dokázali jste zjistit příčinu epileptické encefalopatie u všech sledovaných dětí? A které geny se uplatňovaly nejvíce?
Genetickou příčinu těžké epilepsie jsme v rámci projektu objasnili u 66 pacientů, což představuje zhruba 29 procent – pro srovnání, u dědičných neuropatií máme i bez použití NGS metod objasněnost asi šedesátiprocentní. Nicméně mezi jednotlivými věkovými skupinami byly poměrně velké rozdíly. Pokud se epileptické záchvaty objevily už v novorozeneckém věku, do šestého týdne života, podařilo se příčinu najít až u 69 procent z nich, zatímco třeba u dětí ve věku půl roku až rok to bylo zhruba u třetiny a u nemocných starších čtyř let v necelých 30 procentech. Je tudíž zřejmé, že nejúčelnější je vyšetřovat pacienty s prvními záchvaty již velmi časně po narození.
Příčinné mutace jsme detekovali ve třiceti z více než stovky vyšetřených, sekvenovaných genů, přičemž pouze ve čtrnácti z nich to bylo opakovaně – nejčastěji šlo o geny SCN1A, KCNQ2, WDR45, SCN8A a STXBP1. Nezjistili jsme však žádný gen, ve kterém by byly kauzální mutace natolik prevalentní, tj. že by se vyskytovaly u více než tří procent vyšetřovaných, aby mělo smysl je testovat samostatně. To jen ilustruje, jak moc heterogenní a vzácné mohou příčiny závažných dětských epilepsií být.
- Podstoupili pacienti, u kterých se důvod jejich nemoci pomocí NGS panelu genů odhalit nepovedlo, nějaká další vyšetření?
Ne všichni, jen ti znovu a pečlivě vyhodnocení s ohledem na začátek i průběh nemoci a také odpověď na léčbu. Z nich jsme vybrali 24 dětí, u kterých jsme skutečně předpokládali genetickou příčinu. V druhé fázi jsme pak provedli a vyhodnotili sekvenování celého jejich exomu, to znamená vyšetření téměř všech kódujících částí téměř všech zhruba 20 000 genů. Výsledkem bylo, že se nám podařilo objasnit původ epileptické encefalopatie u dalších osmi pacientů. Takže nový expertní výběr vedl k záchytu 33 procent a k celkovému navýšení efektivity, tedy k zjištění genetické příčiny dohromady u 74 nemocných.
Pokud jsme po celoexomovém sekvenování nenašli žádnou závažnou poruchu v některém ze 6 000 genů spojovaných s lidskými chorobami, provedli jsme stejné vyšetření i u rodičů, abychom opět vyhodnotili, které genetické varianty má pouze dítě a nemá ani jeden z rodičů – takových je v exomu jedna až pět –, a to v genech, které ještě nikdo nedával do souvislosti právě s epilepsií. Takto jsme například u jednoho pacienta objevili mutace v genu UBTF9, který do té doby nebyl popsán jako příčina těžké dětské epilepsie. A zhruba po půl roce vyšel v jednom zahraničním časopise článek, kde bylo uvedeno sedm pacientů s úplně stejnou mutací v tom samém genu, čímž se vlastně potvrdilo, že jsme měli pravdu. Jsme rádi, že díky projektu AZV se nám podařilo zvýšit úroveň genetické i neurologické diagnostiky časných a závažných dětských epilepsií a epileptických encefalopatií v České republice, aby se přiblížila nejvyspělejším zemím. Dokážeme tak pacientům a jejich rodinám poskytnout nejmodernější diagnostické metody, které bylo dříve potřeba hledat v zahraničí.
- Co kromě zavedení DNA diagnostiky těchto onemocnění považujete za nejpřínosnější pro běžnou klinickou praxi?
Pro pacienta, rodinu i společnost má podle mého názoru jednoznačně největší význam ukončení takzvané diagnostické odysey, kdy dítě už nemusí být vystaveno zbytečným a opakovaným vyšetřením – ať už zobrazovacími metodami v celkové anestezii, mozkomíšního moku, kožním a svalovým biopsiím nebo spoustě neurofyziologických testů. A konec konců ani zbytečnému zkoušení terapie včetně nákladných antiepileptik. Zpřesnění genetické prognózy mimo jiné ukáže, že u některých pacientů není dobré nasazovat moderní přípravky, které zvyšují riziko nežádoucích účinků, ale efekt nepřinesou. Nebo že se lze některých léčiv vyvarovat, vybrat jiná, případně že někdy postačí, když jsou podávány základní léky na potlačení záchvatů a symptomů epilepsie. Ze studií například víme, že pro jedince s mutací genu CDKL5 bohužel neexistuje žádná vhodná léčba, proto nemá smysl u nich indikovat agresivní terapii s nadějí, že se zlepší. Cílený výběr a optimalizace antiepileptické léčby pochopitelně vedou i ke snížení počtu hospitalizací.
Musíme si také uvědomit, že ve většině případů, jak už jsem naznačoval, je nově vzniklá mutace jako příčina závažné dětské epilepsie nebo epileptické encefalopatie sice špatnou zprávou pro samotného pacienta, vzhledem k obvykle špatné klinické prognóze, ale mnohdy velmi dobru zprávou pro všechny ostatní v rodině s ohledem na nezvýšené riziko opakování. Příznivá genetická prognóza tudíž umožní další reprodukci a potomky bez postižení.
- Překvapilo vás při výzkumu něco?
Nevím, zda úplně překvapilo, ale určitě byla velice cenná vlastní zkušenost s genetickou diagnostikou pacientů oproti tomu, když jsme si o ní jenom četli. Obrovsky jsme si rozšířili naše klinické obzory, protože u nemocných, o kterých jsme si mnohdy mysleli, že mají těžkou epilepsii, se nakonec důvodem jejich obtíží ukázala být třeba dědičná neurodegenerace nebo i jiné nepoznané onemocnění s epileptickými záchvaty. Tím, že jsme našli řešení v podobě objasněné příčiny dané nemoci, jsme si mohli snáz poskládat všechny informace dohromady a lépe jsme viděli, které z mnoha příznaků jsou ty nejdůležitější.
Díky celoexomovému sekvenování se nám třeba podařilo objevit dvě různé de novo mutace v genu SETBP1 u pacientů se symptomy Schinzelova‑Giedionova syndromu. Jedná se o velmi vzácnou genetickou poruchu, která je charakterizována typickými rysy v obličeji, výrazným zpožděním vývoje, záchvaty a abnormalitami skeletu.
- Za projekt jste získal ocenění ministra zdravotnictví. Jak je vnímáte?
Určitě je pro nás velkou poctou, že jsme se dostali v konkurenci více než 150 řešitelů, a původně asi 600 žádostí, mezi desítku nejlepších a obdrželi čestné uznání za výsledky. Ale musím podotknout, že je to práce opravdu celého týmu, já jsem měl pouze nápad a byl jsem organizátor. Nyní mi ještě větší radost udělala kolegyně MUDr. Petra Laššuthová, Ph.D., moje bývalá postgraduální studentka, jež nedávno získala od ministra zdravotnictví cenu – ne jen čestné uznání, které jsme v minulosti získali už třikrát – za paralelně probíhající projekt AZV, který byl ukončen v roce 2019. Ten byl zaměřen na objasnění příčin vzácných typů dědičných neuropatií pomocí celogenomového a celoexomového sekvenování. Ocenění však dosud nebylo předáno kvůli protiepidemickým opatřením a omezením.
- Na kterých dalších výzkumných aktivitách v současnosti pracujete?
Pokračujeme v projektech zaměřených na etiologii dědičných neuropatií, v tom máme největší a nejdelší zkušenost. Dále v diagnostice dětských epilepsií a encefalopatií, ve vyšetřování příčin hereditárních spastických paraparéz nebo vzácnějších příčin časné nesyndromové hluchoty pomocí NGS metod. Dlouhodobě se věnujeme i genetickým onemocněním u Romů, kdy jsme v minulosti objevili mnoho praktických poznatků využitelných pro efektivní diagnostiku a genetické poradenství. Vedení laboratoře jsem však po 23 letech předal právě Petře Laššuthové, která má další projekty.
- Co by si podle vás lékařská genetika a dětská neurologie v ČR zasloužila do budoucna – jinými slovy, v čem máme ještě rezervy?
Dětská neurologie je u nás na vysoké úrovni, epileptologie určitě na nejvyšší. Rezervy vidím v efektivitě a skutečné podpoře specializovaných center – ani ne tak finanční, ale systémové –, která je bohužel nedostatečná. Řada špičkových odborníků, ať už v oblasti neuromuskulárních onemocnění, neurogenetiky a dalších, nemá potřebnou oporu ani v některých velkých nemocnicích, a díky svému nadšení pak vydávají síly i čas na jiné věci než na péči o pacienty. A to je špatně pro všechny. Nicméně vzhledem ke svému věku a 26 letům kariéry v České republice vím dobře, jak moc se úroveň péče za posledních 20 let zlepšila. Nedávno jsme se dokonce dočkali možnosti kauzální terapie pro geneticky podmíněná neurologická onemocnění, bez léčby smrtelná, jako je spinální svalová atrofie. A přibývají a budou přibývat další.
Zdroj: MT