Pomohou uzdravené plazmidy snížit rezistenci vůči karbapenemům?

Vývoj nových antibiotik je přitom časově i finančně náročný, proto se zkoušejí i jiné přístupy, jak šíření odolných mikrobů zabránit. Jedním z nich je „vymazání“ plazmidů – mobilních genetických elementů, které si bakterie předávají.

Nejen vyhledávání skrytých rezervoárů multirezistentních kmenů enterobakterií a pseudomonád a jejich molekulárněgenetickému popisu, ale také výzkumu toho, jak přímo v mikrobiální populaci odstranit plazmidy kódující odolnost vůči antibiotikům, se spolu se svým týmem dlouhodobě věnuje mikrobiolog prof. Ing. Jaroslav Hrabák, Ph.D., manažer Biomedicínského centra Lékařské fakulty UK v Plzni. Na konci roku 2019 získal ocenění ministra zdravotnictví za projekt podpořený grantem Agentury pro zdravotnický výzkum ČR (AZV).

• Jak velký medicínský problém multirezistentní bakterie v současnosti představují?

Z historického pohledu víme, že se antibiotická rezistence začala objevovat poměrně záhy po zavedení této lékové skupiny do klinické praxe. Je zajímavé, že svou efektivitu si nejdéle zachoval tradiční penicilin a některé mikroby mu nejsou schopny odolávat dodnes – například Streptococcus pyogenes, původce běžných tonzilitid. Pokud bychom se ale podívali na antibiotika nové generace, která jsou k dispozici v posledních dvou desetiletích, zjistíme, že k rezistenci dochází už během několika let od uvedení do praxe. To samozřejmě představuje velký problém, který ovlivňuje nejen konkrétní léčbu pacientů, ale i vývoj dalších nových přípravků a terapeutických přístupů k infekčním onemocněním. Odhaduje se totiž, že vývojový proces jednoho antibiotika trvá asi dvanáct let a stojí necelých 1,7 miliardy dolarů. Délka patentové ochrany se přitom pohybuje maximálně do dvaceti let, to znamená, že v průběhu osmi let by se měly investované prostředky vrátit. Což se ale za tak krátkou dobu nestane – a to je také jeden z důvodů, proč máme nedostatek nových antibiotik.

Výskyt antibiotické rezistence je tedy celosvětovým tématem, přičemž jsou známy bakteriální izoláty běžných patogenů, například Klebsiella pneumoniae nebo Pseudomonas aeruginosa, které nejsou běžně dostupnými přípravky řešitelné. Pokud bychom s tím nic nedělali, nebyli bychom schopni léčit především multirezistentní infekce, které jsou spojeny s poskytováním zdravotní péče, a dostali bychom se do předantibiotické éry.

• Podílejí se na vzniku multirezistentních kmenů také environmentální vlivy, např. nadužívání antibiotik u zvířat?

Určitě ano. Rezistentní mikroby se pochopitelně vytvářejí nejen v prostředí humánní medicíny, ale také v medicíně veterinární a může docházet k vzájemnému přenosu. V obou těchto oblastech se totiž ročně spotřebuje přibližně stejné množství antibiotik – v ČR je to zhruba 65 tun u lidí a 65 tun u zvířat. Jedná se proto o dvě spojené nádoby, tento problém se v poslední době označuje jako „one health“, jedno zdraví.

Nicméně dalším, neméně důležitým aspektem je pronikání odolných bakterií do prostředí třeba odpadními vodami, tam pak kolonizují volně žijící zvířata. Potom může docházet ke vzniku skrytých rezervoárů rezistence, které mohou ovlivňovat populaci, aniž bychom o tom věděli.

• Co vlastně za odolností mikrobů stojí?

Víme, že k šíření rezistence konkrétních bakteriálních kmenů může docházet klonálně. To je typické pro nozokomiální nákazy, které se přenášejí kontaminovanýma rukama zdravotnického personálu. V tomto případě je asi nejznámějším původcem methicilin rezistentní Staphylococcus aureus – MRSA.

U běžných gramnegativních bakterií, například enterobakterií, se však ukazuje, že na jejich rezistenci se podílí zejména šíření plazmidů – mobilních genetických elementů, které mikrob nutně nepotřebuje ke svému přežití, ale přinášejí mu určitý benefit. Mohou třeba kódovat geny pro rezistenci právě vůči antibiotikům, nebo dokonce vůči některým dezinfekčním látkám, a ovlivňují také metabolické dráhy, takže je bakterie schopna utilizovat některé živiny, které by jinak využít nedokázala. Bakterie si navíc dokážou plazmidy předávat, a to i mezidruhově. U řady pacientů kolonizovaných třeba kmenem Klebsiella pneumoniae proto vídáme, že plazmid, který nese gen pro rezistenci ke karbapenemům typu OXA‑48, se v gastrointestinálním traktu během týdne rozšíří na všechny možné druhy enterobakterií. Hyperkolonizace multirezistentními kmeny samozřejmě zvyšuje riziko přenosu.

• Čím lze tyto mechanismy rezistence překonat?

Musíme si uvědomit, že bojujeme s nepřítelem, který se dokáže rozmnožit během 20 minut, takže k němu musíme přistupovat opravdu komplexně. Obecně je na prvním místě prevence, to znamená vyhledávat skryté zdroje rezistence a zjišťovat jejich cesty šíření v oblasti humánní i environmentální. Druhým klíčovým bodem je správná indikace antibiotik, protože jak už jsem naznačil, jejich nadužívání je jednoznačně zodpovědné za selekci antibiotické rezistence. A pak se hledají nové přístupy k léčbě infekčních nemocí. Zatím jen na experimentálních modelech se například zkoumají možnosti, jak inhibovat virulenci mikrobů nebo jak z bakteriální buňky „vymazat“ případný gen pro rezistenci.

• Pojďme k vašemu oceněnému projektu, který probíhal v letech 2015–2018. Co bylo jeho hlavním cílem a proč jste se zaměřili právě na enterobakterie a pseudomonády?

Na projektu jsme spolupracovali s Veterinární a farmaceutickou univerzitou Brno, konkrétně s týmem docentky Moniky Dolejské z Fakulty veterinární hygieny a ekologie, který se odolností vůči antibiotikům zabývá intenzivně a dlouhodobě. Naším cílem bylo vyhledávat skryté rezervoáry rezistence ke karbapenemům, které jsou léky volby u nejzávažnějších, multirezistentních infekcí, a porovnat environmentální bakteriální izoláty s těmi humánními, abychom byli schopni říci, jakými mechanismy se mohou šířit. Provedli jsme tedy komplexní molekulárně‑epidemiologickou analýzu klinicky významných genů rezistence a plazmidů u enterobakterií a pseudomonád.

Tyto gramnegativní bakterie jsme zvolili proto, že jsou zodpovědné za vznik velké části nemocničních i komunitních nákaz. V současné době se ukazuje, že enterobakterie, mezi které patří i Escherichia coli, nejčastější původce infekcí močových cest, mohou být velmi podstatným zdrojem rezistence, přičemž jsou popisovány kmeny odolné ke všem dostupným antibiotikům. Obdobné je to u pseudomonád, jež představují typického původce nozokomiálních infekcí. V tomto případě se rezistence šíří spíše klonálně, nicméně i náš tým detekoval mobilní genetické elementy, které způsobují přenos této rezistence u tohoto rodu bakterií.

• Které metody jste při typizaci multirezistentních kmenů využili a k jakým výsledkům jste dospěli?

Stěžejním nástrojem jsou pro nás metody celogenomové sekvenace, které se do epidemiologické praxe infekčních nemocí dostaly asi před sedmi lety a dnes jsou používány naprosto rutinně. Naše laboratoř také disponuje sekvenátorem, který s velmi vysokou přesností dokáže během dvou až tří dnů přečíst kompletní bakteriální genom bez jakýchkoli dalších experimentů. Tento přístroj nám jednoznačně pomáhá získávat velké množství stěžejních informací. V průběhu projektu jsme tedy mapovali bakteriální izoláty jak pomocí klasických mikrobiologických metod, tak s využitím sekvenování. Díky tomu jsme mohli sledovat nejen genetický základ rezistence, ale především to, jakým způsobem se nejvýznamnější karbapenemázy – enzymy, které hydrolyzují a inaktivují karbapenemy – šíří. Popsali jsme přitom řadu nových plazmidů, jež odolnost vůči těmto antibiotikům způsobují, a rovněž i mechanismy jejich vzniku.

• Jak se vaše výzkumné výsledky odrazily v běžné klinické praxi?

Co se týká praktických poznatků, prokázali jsme například, že i v tuzemských zdravotnických zařízeních se objevují neočekávané ekologické niky, kde můžeme zaregistrovat antibiotickou rezistenci. V této souvislosti jsme se zabývali studií z jedné pražské nemocnice, kde analyzovali, jakou mikrobiotou jsou osídleny ruce zdravotnického personálu, a mimo jiné odhalili izolát bakterie Leclercia adecarboxylata se sníženou citlivostí ke karbapenemům. Když jsme tento izolát detailně osekvenovali, zjistili jsme, že produkuje jednu z významných karbapenemáz označovaných jako VIM. Pozoruhodné ovšem bylo, že na daném pracovišti se nikdy předtím nevyskytl případ producentů těchto karbapenemáz a že za necelý rok se tentýž plazmid objevil u kmene Klebsiella pneumoniae v jiné pražské nemocnici.

Díky projektu AZV jsme se také zapojili do několika mezinárodních epidemiologických studií, takže ČR mohla poskytovat velmi přesná data o rezistenci na karbapenemová antibiotika. Klíčovým přínosem je pak její včasná a rychlá diagnostika s cílem poskytnout ošetřujícím lékařům co nejdříve odpověď na to, které mikroby se šíří, tudíž jakou léčbu mají zvolit a jak zabránit dalšímu přenosu. Situaci ohledně rezistence ke karbapenemům máme na území naší republiky docela dobře zmapovanou, takže jsme schopni klinickým laboratořím „ušít diagnostiku na míru“ – a to v relativně krátké době několika hodin, oproti standardním metodám, které trvají i déle než jeden den. I z hlediska prevence šíření multirezistentních kmenů se snažíme pro konkrétní pracoviště nalézat optimální řešení. Ne vždy, třeba z kapacitních důvodů, je totiž možné pacienty izolovat od okolí tak, jak bychom si představovali.

• Překvapilo vás při výzkumu něco?

Asi nejzajímavější případ šíření rezistence ke karbapenemům, který popsali naši spoluřešitelé z Brna, pocházel z Austrálie. U tamějších racků totiž objevili stejné genetické elementy kódující karbapenemázy typu IMP, které byly nalézány i u pacientů. Ukázalo se nakonec, že populace racků se pohybovaly v blízkosti skládky, kam byly odváženy inkontinenční pleny z nemocnic a které mohli ptáci ozobávat. Díky tomu se kolonizovali a fungovali jako další vektory šíření rezistence.

• Navázali jste na danou problematiku nějakým dalším grantem, respektive na čem nyní pracujete?

Aktuálně se nesoustředíme pouze na epidemiologii a molekulárněgenetický popis rezistence ke karbapenemům, ale snažíme se hledat řešení, jak přímo v mikrobiální populaci odstranit plazmidy kódující odolnost vůči antibiotikům. To by však nebylo možné právě bez projektu AZV ČR, který nám umožnil provést celogenomovou sekvenaci plazmidů a nalézt správné cílové struktury pro vymazání těchto molekul DNA z bakteriální buňky. Jedná se o metodu „plasmid curing“, která – zjednodušeně řečeno – spočívá v tom, že plazmid nesoucí geny rezistence z buňky „vymažeme“. Zároveň pracujeme na vývoji metody, pomocí níž by bylo možné vpravit do bakterie genetickou informaci, která se nebude replikovat, ale dokáže bakteriální buňku zbavit antibiotické rezistence. V současnosti již probíhá patentové řízení na tuto technologii.

• Za projekt jste získal ocenění ministra zdravotnictví – co to pro vás znamená?

Je to samozřejmě velká pocta pro celou naši výzkumnou skupinu. Zároveň to vnímáme jako potvrzení důležitosti mikrobiologie včetně problematiky multirezistentních kmenů a jako závazek, abychom ve výzkumu pokračovali a přinášeli další výsledky.

• Jak vůbec vnímáte účelovou podporu ministerstva zdravotnictví cestou AZV ČR?

Domnívám se, že řada pracovišť, která jsou spojena s klinickou medicínou, by se bez grantů cílených na aplikovaný biomedicínský výzkum obešla jen obtížně. To znamená, že AZV ČR má v daném ohledu zcela nenahraditelnou roli a jednoznačně pomáhá zvyšovat konkurenceschopnost české medicíny a lékařské vědy v celoevropském, ne‑li celosvětovém měřítku.

• A jak byste zhodnotil tuzemský biomedicínský výzkum pohledem manažera plzeňského Biomedicínského centra?

Jsem poměrně optimista a myslím si, že rozhodně nepatříme mezi země, které by byly na chvostu EU. Naopak, máme u nás spoustu skvělých výzkumných center a týmů – ať už v Praze, Brně, nebo Olomouci –, které produkují špičkové výstupy. Aktuální pandemie COVID‑19 navíc ukazuje, že výzkum v oblasti lékařských věd je nezastupitelný. I proto si zaslouží dlouhodobou podporu. Jisté rezervy vidím právě v délce trvání grantů. Ačkoli musím říci, že v posledních letech se to výrazně zlepšilo a čtyřleté granty mohou na poměrně dlouhou dobu poskytnut stabilní financování určitého typu výzkumu. Nicméně dlouhodobější časový rámec, třeba osmi až deseti let, by byl ideální.

• Kterými výzkumnými směry se vaše centrum zabývá?

Hlavním profilovým tématem jsou infekční nemoci. Dlouhou tradici má na naší lékařské fakultě problematika sepse včetně jejího modelování, patofyziologických aspektů či řešení antibiotické rezistence a také oblast virových infekcí u pacientů s transplantovanou ledvinou. V našem Biomedicínském centru dále existují silné týmy zaměřené na experimentální chirurgii, nádorovou biologii a epidemiologii nádorových onemocnění, pro kterou se nám nedávno podařilo získat vynikajícího vědce z univerzity v Heidelbergu – profesora Kariho Hemminkiho. A pak máme menší výzkumné směry, jako jsou reprodukční imunologie nebo experimentální neurofyziologie, které jsou však neméně významné. Například kolega Karel Ježek, zabývající se studiem paměti, působil několik let v trondheimském Kavliho institutu pro systémové neurovědy jako post‑doc v laboratoři manželů Moserových, nositelů Nobelovy ceny za výzkum mozku.

S potěšením musím konstatovat, že se nám stále častěji daří atrahovat výzkumné pracovníky ze zahraničí, zejména Ph.D. studenty a postdoktorandy. V našich laboratořích je tedy slyšet nejen úřední vědecký jazyk angličtina, ale i španělština, němčina a jiné.

• Řešíte i vysoce aktuální problematiku infekce SARS‑CoV‑2?

Řešíme ji kontinuálně. Osobně totiž pracuji také v Ústavu mikrobiologie LF UK a FN Plzeň, kde nás zajímají především nové mutace viru SARS‑CoV‑2. Nyní jsou sice hojně skloňovány některé významné mutace, třeba britská nebo jihoafrická, málo se ale mluví o tom, že jich bylo popsáno opravdu velké množství. Dokonce již vznikly studie, které poukázaly na to, že bylo možné geograficky velmi přesně dohledat původce daného viru. Kolegové z Basileje, se kterými spolupracujeme v oblasti klinickomikrobiologického výzkumu, již na jaře popsali vlastní basilejský kmen, který nebyl příbuzný s žádným jiným vyskytujícím se u sousedních států Francie nebo Německa.

Zdroj: MT