O genové chirurgii, Che, Lulu a Naně

V listopadu 2018, přes YouTube a pak na konferenci v Hongkongu, odhalil doktor Jiankui He (v českém přepisu Ťien‑kchuej Che) ze Southern University of Science and Technology v Šen‑čenu, že jeho tajný pokus s genetickou modifikací lidských embryí se v jednom ze sedmi případů „podařil“. Ženě (Grace) s HIV pozitivním partnerem (Markem) se 8. 11. měla narodit zdravá dvojčátka. První z nich má v médiích jméno Lulu, stejné jako hrdinka ve své době skandálního příběhu Wedekinda o zneužívané dívce a osudové milence, vzpomínané i v hudebním albu skupiny Metallica z roku 2011. Druhou dívku Che na veřejnosti nazývá Nana, stejně jako se jmenuje kurtizána v románu Émila Zoly. Nic proti jeho výběru – nějaká jména vybrat musel a možná v čínštině pěkně znějí. Chvályhodné je, že skutečná jména dívek a jejich rodičů drží v tajnosti.

Dívky mají mít gen CCR5 modifikovaný takovým způsobem, aby zabránil infekci HIV. Produktem genu CCR5 je chemokinový receptor na T lymfocytech, makrofázích, dendritických buňkách, eosinofilech a mikrogliích, který má protektivní roli při infekčních a parazitických onemocněních a zároveň se podílí na postinfekčním zánětu (1). V únoru 2019 se v médiích rozvířila informace, že kromě rezistence na HIV budou mít holčičky výbornou paměť a budou nejspíše i nadprůměrně inteligentní (2).

Nabízí se řada otázek: zakládají se tato tvrzení na pravdě? Je vůbec něco takového možné? Je to úspěch čínské vědy, která se nezdržuje vleklými spory o vlastnictví patentů CRISPR‑Cas9 a provedla odvážný krok, kterého se ostatní vědci bojí? Zaslouží dr. Che za svůj čin obdiv, anebo v Číně překročili etickou hranici, která by překročena být neměla? Co bude následovat?

Vezměme příběh Che, Lulu a Nany chronologicky

Dr. Che není lékař a nemá vzdělání v bioetice nebo evoluční biologii, což jsou obory, které rámují pokusy v lidském genetickém inženýrství. Vystudoval biofyziku na Rice University a stážoval na Stanford University. Má doktorát ze sekvenování DNA; zároveň má utilitární, inženýrský pohled na věc a podnikavého ducha. Sekvenační metodu zbankrotované americké firmy Helicos Biosciences, která byla převálcována konkurenční firmou Illumina, oživil v Číně pod názvem Direct Genomics. Pod názvem Vienomics Biotech začal komerčně nabízet sekvenační servis onkologickým pacientům. A hledal další komerční příležitosti.

V roce 2012 bylo popsáno laboratorní editování genomu za využití protifágového imunitního systému bakterií (kombinace CRISPR, segmenty nahromaděných pravidelně rozmístěných krátkých palindromických repetic, clustered regularly interspaced short palindromic repeat a RNA řízené DNA endonukleázy Cas9, CRISPR associated protein 9). Jedná se o revoluční metodu genetického inženýrství, hodnou Nobelovy ceny, se kterou dr. Che získal zkušenosti na americké stáži (3). Dr. Che si uvědomil možnosti metody a začal provádět CRISPR pokusy na embryích opic. Své výsledky prezentoval na konferenci The First International Summit on Human Gene Editing 2015 ve Washingtonu. Zde si několikrát vyslechl, že genetické modifikace somatických buněk nemocí postižené tkáně člověka se považují za eticky akceptovatelné a klinické zkoušky pro několik genetických editací už začaly (například pro beta-talasémii nebo i pro genetickou modifikaci CCR5 v T lymfocytech) (4), zatímco pustit se do klinického použití genetické modifikace zárodečné linie by bylo nezodpovědné a některé země ho přímo zakázaly. Pro zákaz jsou pádné důvody. Následky použití metody ještě nejsou dostatečně prozkoumané. Zároveň genetická modifikace zárodečné linie zavání eugenikou, praktikami negativní a pozitivní selekce na lidské populaci, které jsou skvrnou na politice mnoha jinak demokratických zemí v první polovině 20. století, nemluvě o eugenicky zdůvodněné genocidě ve fašistickém Německu. Genetická změna se projeví ve všech buňkách nositele a přenese se do další generace, takže použití takhle mocného nástroje se musí důkladně zvážit. Musejí se vyřešit otázky ohledně bezpečnosti a účinnosti metody, porovnat rizika s výhodami a možnými alternativami. Pak by se měla lidská společnost (nikoli pouze konkrétní genetický inženýr a konkrétní pár) shodnout ohledně přijatelnosti dané aplikace. Na tomto postoji je celosvětově založeno už více než 60 doporučení o lidském genetickém inženýrství, mezi jinými doporučení ARRIGE (Association for Responsible Research and Innovation in Genome Editing), doporučení NASEM (the United States National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine Committee on Human Gene Editing) (5).

Ke klinické zkoušce genetického inženýrství u lidí se může přistoupit tehdy, když:

• není jiná přijatelná alternativa;

• cílem je předcházet závažné chorobě;

• výzkum se soustředí jen na editování genů, které predisponují k chorobě nebo ji přímo způsobují;

• genová konverze pravděpodobně nezpůsobí zdravotní a nežádané efekty;

• jsou dostupná spolehlivá data ohledně preklinických a klinických rizik;

• výzkumné instituce mají zavedeno kontinuální sledování zdraví a bezpečí účastníků klinického pokusu;

• je naplánováno a prováděno dlouhodobé sledování;

• fungují mechanismy, které zaručují zároveň transparentnost vědeckého pokusu a soukromí dotyčných osob;

• společenská rizika jsou pod kontrolou;

• metoda neumožňuje rozšířené použití k jiným účelům, než je zabránění závažné chorobě nebo stavu.

Dr. Che si po zkušenostech s opicemi jako cíl genetického inženýrství vybral gen CCR5 v lidských párech, kde je muž HIV pozitivní. Gen CCR5 se totiž v lidské populaci vyskytuje i ve variantě s delecí, která se na bílkovinné úrovni projeví nefunkčním CCR5 transmembránovým receptorem. Pokud deleci dítě zdědí po otci i po matce (je CCR5 delta 32 homozygot), tak nejčastější kmen viru HIV nemůže infikovat lidský lymfocyt T, protože HIV využívá CCR5 pro svůj vstup do buňky jako koreceptor receptoru CD4. Méně časté kmeny viru HIV využijí jako koreceptor CXCR4, takže proti nim ochrana delecí CCR5 není účinná.

Vlastnosti CCR5 delta 32 homozygota byly sledovány u Timothy Ray Browna, amerického studenta v Berlíně, zvaného „berlínský pacient“ (6). Brown byl nakažen virem HIV v roce 1995 a zároveň u něj propukla leukémie. V roce 2007 se pro něj podařilo najít takového dárce kostní dřeně, který je nejen HLA‑ ‑slučitelný, ale zároveň i CCR5 delta 32 homozygot. Po transplantaci nastoupily potenciálně fatální komplikace – reakce štěpu proti hostiteli a leukoencefalopatie. Nicméně pacient přežil, a navíc se v jeho krvi nenašel žádný virus HIV. Přestože to může být účinkem chybějícího receptoru CCR5, spíše to vypadá na vybití všech hostitelských infikovaných T lymfocytů jako vedlejší účinek reakce štěpu proti hostiteli. HIV „vyléčení“ se totiž podařilo i u dalších pěti transplantací kostní dřeně, u kterých delece CCR5 v dárcovské dřeni nebyla přítomna.

Homozygotní stav pro deleci CCR5 se v české populaci vyskytuje s frekvencí kolem 3 promile (7) a jeho nositelé nejsou nijak viditelně postiženi, ale blíže zkoumáni nebyli. Dr. Che jako opodstatnění své klinické zkoušky uvedl zdánlivě altruistický důvod, že chce zabránit infekci plodu virem HIV pocházejícím od otce. Promytí spermií před IVF, případně gradientová centrifugace, zbaví spermie všech virů HIV, takže dítě se narodí zdravé tak jako tak. Aby zdravé zůstalo, nesmí se dostat do přímého kontaktu s infikovanými tělesnými tekutinami, jako je krev, semeno, vaginální tekutina a mateřské mléko, což vyžaduje režim úspěšně praktikovaný v mnoha rodinách s HIV pozitivním členem. Nákaze tím obecně nejčastějším způsobem – nechráněným pohlavním stykem v dospělosti – lze zabránit sexuální zdrženlivostí a používáním kondomu. Nákaze druhým nejčastějším způsobem – sdílením injekční stříkačky mezi narkomany – lze zabránit použitím jednorázových injekčních stříkaček (anebo, v první řadě, vyhýbáním se injekčně podaným drogám). Takže medicínské opodstatnění zárodečné genetické modifikace jako ochrana dítěte proti HIV je nedostatečné a jedná se o porušení pravidel genetického inženýrství doktorem Che. Přitom je medicínsky žádaných cílů plno: například Tayova‑Sachsova choroba, Huntingtonova chorea, svalová dystrofie, fenylketonurie, cystická fibróza, srpkovitá anémie…

Jak je to s potenciálními vedlejšími účinky vnesené mutace do genu CCR5? Přestože přírodní CCR5 delta 32 homozygoti nejsou viditelně postiženi, neznamená to, že povedená genetická modifikace na jiném genetickém pozadí bude také bez následků. Při přirozeném oplodnění jsou v případě závažné genetické odchylky oplozená vajíčka vstřebána, dojde k samovolnému nebo zamlklému potratu nebo bude jedinec neplodný. Je riziko, že pokud CCR5 modifikujeme bez změny dalších genů, některá jeho funkce bude chybět. Ale je také možné, že role CCR5 se omezuje na nějaké molekulární slepé střevo. Jak bylo zmíněno výš, je nutné shromáždit dostatek informací a rozhodnout se na základě zvážení přínosů a rizik.

Pokud to vezmu z pozitivní stránky, pokusy na myších naznačují, že nefunkční CCR5 zlepšuje signalizaci MAPK/CREB a prodlužuje uvolňování neuromediátoru z aktivované synapse po její opakované stimulaci, což by mohlo zvyšovat nervovou plasticitu, zlepšovat učení a paměť (8). Maraviroc a Cenicriviroc jsou antivirotika cílená proti CCR5, která pomáhají snížit neurokognitivní chátrání pacientů s AIDS (9). Je možné, že inaktivace CCR5 bude mít protektivní účinek i u aterosklerózy u Asiatů (10), u pravých neštovic (11), roztroušené sklerózy a dalších zánětlivých onemocnění mozku (12). Podle pokusů na myších a na základě sledování lidských pacientů může nefunkční CCR5 urychlit zotavení po mozkové mrtvici (13–15). Takže mediální rozvíření tématu designových dětí ze zkumavky se zakládá na reálných předběžných datech. Není třeba zdůrazňovat, že si genetičtí inženýři sami stanovili omezení, že germinální mutace se nebudou provádět za účelem „genetic enhancement“. Pokud se rodičům umožní rozhodování v tomto směru, už víme, co lze očekávat: již dnes probíhá v Číně a Indii selekce plodu podle pohlaví v tak masovém měřítku, že se rodí o třetinu více chlapců, než jak by to bylo podle přírody. Pokud se jednou taková technologická možnost objeví, nestačí kriminalizace k zabránění jejímu použití (16). Zároveň není jasné, kdo by měl určovat, jaké lidské vlastnosti jsou ty nejlepší. Jakékoli snížení populační variability zvyšuje fragilitu celého druhu. Stačí pak změna podmínek, například zvýšení infekčního tlaku nemoci, proti které nelze očkovat, a populace může být zdecimována. V našich lesích máme před očima apokalyptický obraz řádění kůrovce na smrkových monokulturách, když došlo ke globálním klimatickým změnám.

Chybějící CCR5 může na základě předběžných dat zhoršit funkci osteoklastů při vývoji kostí (11), zdramatizovat průběh chřipky (17), herpetické encefalitidy (18), západonilské horečky (19,20), klíšťové encefalitidy (21), japonské encefalitidy (22), oční manifestace toxoplazmózy (23). Dílčí informace o roli CCR5 se začínají shromažďovat, ale ještě jich není dostatek, aby umožnily rozhodování pro pokus na člověku.

Před započetím jakýchkoli pokusů na lidech je potřeba získat souhlas etické komise a informovaný souhlas dotčených osob. Dr. Che se s tímto požadavkem vypořádal nefér způsobem. Informovaný souhlas klienti podepsali, ale obsah tohoto souhlasu nesplňuje potřebné parametry. Mluví se zde o vakcinaci proti HIV/AIDS místo o genetické modifikaci zárodečné linie a koncepce odpovídá spíše komerční smlouvě o PR zastoupení nebo subdodávce. Genetický informovaný souhlas má být s pacientem konzultován klinickým genetikem nebo osobou proškolenou v genetickém poradenství. Dr. Che souhlas s klienty konzultoval osobně, přestože není klinický genetik a požadované školení neabsolvoval. Není jasné, zdali ke svému pokusu měl dr. Che kladné rozhodnutí etické komise, protože si ze své univerzity vzal neplacené volno a pokusy prováděl bez institucionálního nebo grantového financování a mimo prostory univerzity. Pokusy prováděl s konzultací prof. Michaela Deema, který má podíl v jeho komerčních společnostech.

Dr. Che při klasické IVF s přečištěnými spermiemi vstříkl do vajíčka i CRISPR‑Cas9 reagencie. Před implantací oplodněného vajíčka při IVF pomocí sekvenace překontroloval, zda došlo ke chtěné genetické modifikaci. Sekvenování nepotvrdilo off‑target efekt, genetickou záměnu na úplně jiném místě, než bylo zamýšleno. Omezení použité sekvenační metody však je, že neodhalí velké translokace genetického materiálu. CRISPR‑Cas9 zatím nemá absolutní přesnost při nahrazení úseku DNA, protože krok záměny genetického úseku za jiný se děje mechanismem nehomologní rekombinace (Non‑Homologous End Joining, NHEJ). Tedy spíše než genová chirurgie je to lepší genová řezničina. Není divu, že se mu nepodařilo u obou embryí přesně odstranit 32 nukleotidů v obou kopiích genu CCR5, nicméně se alespoň trefil do oblasti, kde inzerce nebo delece vede ke zkrácenému, nefunkčnímu proteinu CCR5.

U jedné alely genu CCR5 Lulu provedl inzerci jednoho nukleotidu, u druhé alely deleci čtyř nukleotidů. Prvotní sekvenování poukázalo na možný off‑target na pozici chr 1: 69754224, 279 kb od nejbližšího genu, což může být nejspíše sekvenační artefakt, protože nebyl potvrzen druhým sekvenováním.

U jedné alely genu CCR5 u Nany došlo k deleci 15 nukleotidů, druhá alela zůstala nezasažena. Takže Nana není chráněna proti vstupu viru HIV do buňky. U obou holčiček došlo k mozaicismu, genetický profil není stejný v každé buňce (24). Přestože byla CRISPR‑Cas9 mašinérie přítomna už v oplozeném vajíčku, provedla záměnu v několika buňkách až ve stadiu moruly, takže ani u Lulu není jisté, zda je vůči infekci viru HIV chráněna. Z druhé strany to může znamenat, že i případné negativní on‑target a off‑target účinky genetického inženýrství budou omezeny jen na určité linie buněk.

Výsledky výzkumu se mají publikovat v časopisech s recenzním řízením, kde erudovaní odborníci zabrání publikování nepodložených tvrzení – buď článek odmítnou publikovat, nebo ho vrátí k přepracování. Dr. Che odborný článek nepublikoval (článek zaslaný do časopisu Nature byl odmítnut redaktorem bez recenzního řízení) a pro sdělení informací o narození dvojčátek na radu amerického PR konzultanta Ryana Ferrella využil sociální média a pak vystoupení na konferenci. Způsob prezentace výsledků a sama povaha výsledků vyvolala většinový odpor vědecké veřejnosti a překvapivě se nesetkala se vstřícným přijetím ani v Číně – dr. Che měl k 21. 1. 2019 ukončen pracovní poměr na univerzitě a je v současné době v domácím vězení v očekávání soudního řízení, protože porušil čínské zákony (https://www.bbc.com/news/world-asia-46943593). Nezapomeňme, že v Číně je možný trest smrti i za menší přestupky (scienceretractions). Prof. Deem nejspíše ze spolupráce s dr. Che také nevyjde bez ztráty kytičky. U něj hrozí konec vědecké kariéry v USA.

Dr. Che osmi partnerským párům zaplatil náklady IVF, čímž porušil zásady vedení klinické zkoušky (25). V odpovědích novinářům na sebe vzal veškerou zodpovědnost za případná lékařská ošetření, pokud se ukáže, že genetická modifikace způsobí vrozený defekt nebo náchylnost k nějaké nemoci. Nicméně v informovaném souhlasu to má napsáno jinak, používá formulku: „The project team does not assume legal responsibility in this situation“.

Rodina holčiček je prozatím utajena, ale je jen otázkou času, kdy ji investigativní novináři odhalí a vystaví děvčátka statusu nechtěné celebrity, asi jako ovce Dolly. Není úplně vyloučena ani hysterická reakce veřejnosti na případný neúspěch genetické modifikace (vzpomeňme nepodložený strach evropské veřejnosti z GMO potravin), vedoucí k zákazu genetického inženýrství somatických buněk. Je však také možné, že Rubikon už byl překročen a řítíme se ke Konci civilizace jako podle Aldouse Huxleyho. Další klientka dr. Che s editovaným embryem je nyní v raných fázích těhotenství (https://www.wired.co.uk/article/second-crispr-baby).

Poděkování: Projekt byl institucionálně podporován grantem NPU LO1304. Děkuji Dr. Stránské a Dr. Bartákové za korektury textu.

Literatura

(1) Klein RS. A moving target: The multiple roles of CCR5 in infectious diseases. Journal of Infectious Diseases. 2008;197(2):183–186. (2) Regalado A. China‘ s CRISPR twins might have had their brains inadvertently enhanced. MIT Technology Review. 2019. (3) He JK, Deem MW. Heterogeneous Diversity of Spacers within CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Physical Review Letters. 2010;105(12). (4) Maier DA, Brennan AL, Jiang SG, Binder‑Scholl GK, Lee G, Plesa G et al. Efficient Clinical Scale Gene Modification via Zinc Finger Nuclease‑Targeted Disruption of the HIV Co‑receptor CCR5. Human Gene Therapy. 2013;24(3):245–258. (5) Brokowski C. Do CRISPR Germline Ethics Statements Cut It? Crispr Journal. 2018;1(2):115–125. (6) Hutter G, Nowak D, Mossner M, Ganepola S, Mussig A, Allers K et al. Long‑Term Control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 Stem‑Cell Transplantation. N Engl J Med. 2009;360(7):692–698. (7) Drabek J, Petrek M. 32 bp deletion in CCR‑5 gene and human immunodeficiency virus epidemic in the Czech Republic. Acta Virol. 1998;42(2):121–122. (8) Zhou M, Greenhill S, Huang S, Silva TK, Sano Y, Wu SM et al. CCR5 is a suppressor for cortical plasticity and hippocampal learning and memory. Elife 2016;5. (9) Kim MB, Giesler KE, Tahirovic YA, Truax VM, Liotta DC, Wilson LJ. CCR5 receptor antagonists in preclinical to phase II clinical development for treatment of HIV. Expert Opinion on Investigational Drugs. 2016;25(12):1377–1392. (10) Zhang ZW, Liu J, Wang HJ, Wu HX, Wu XM, Dong JJ et al. Association between chemokine receptor 5 (CCR5) delta32 gene variant and atherosclerosis: a meta‑analysis of 13 studies. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2015;8(1):658–665. (11) Xie Y, Zhan SH, Ge W, Tang PF. The potential risks of C‑C chemokine receptor 5‑edited babies in bone development. Bone Research. 2019;7. (12) Martin‑Blondel G, Brassat D, Bauer J, Lassmann H, Liblau RS. CCR5 blockade for neuroinflammatory diseases – beyond control of HIV. Nature Reviews Neurology. 2016;12(2):95–105. (13) Victoria ECG, Toscano ECD, Cardoso ACD, da Silva DG, de Miranda AS, Barcelos LD et al. Knockdown of C‑C Chemokine Receptor 5 (CCR5) is Protective Against Cerebral Ischemia and Reperfusion Injury. Current Neurovascular Research. 2017;14(2):125–131. (14) Li PY, Wang L, Zhou YX, Gan Y, Zhu W, Xia YG et al. C‑C Chemokine Receptor Type 5 (CCR5)‑Mediated Docking of Transferred Tregs Protects Against Early Blood‑Brain Barrier Disruption After Stroke. Journal of the American Heart Association. 2017;6(8). (15) Joy MT, Ben Assayag E, Shabashov‑Stone D, Liraz‑Zaltsman S, Mazzitelli J, Arenas M et al. CCR5 Is a Therapeutic Target for Recovery after Stroke and Traumatic Brain Injury. Cell. 2019;176(5):1143–1157. (16) Eklund L, Purewal N. The bio‑politics of population control and sex‑selective abortion in China and India. Feminism & Psychology. 2017;27(1):34–55. (17) Falcon A, Cuevas MT, Rodriguez‑Frandsen A, Reyes N, Pozo F, Moreno S et al. CCR5 deficiency predisposes to fatal outcome in influenza virus infection. Journal of General Virology. 2015;96:2074–2078. (18) Vilela MC, Lima GK, Rodrigues DH, Lacerda‑Queiroz N, Pedroso VSP, Miranda AS et al. Absence of CCR5 increases neutrophil recruitment in severe herpetic encephalitis. BMC Neuroscience. 2013;14. (19) Cahill ME, Conley S, Dewan AT, Montgomery RR. Identification of genetic variants associated with dengue or West Nile virus disease: a systematic review and meta‑analysis. Bmc Infectious Diseases. 2018;18. (20) Yudin NS, Barkhash AV, Maksimov VN, Ignatieva EV, Romaschenko AG. Human Genetic Predisposition to Diseases Caused by Viruses from Flaviviridae Family. Molecular Biology. 2018; 52(2):165–181. (21) Kindberg E, Mickiene A, Ax C, Akerlind B, Vene S, Lindquist L et al. A deletion in the chemokine receptor 5 (CCR5) gene is associated with tickborne encephalitis. Journal of Infectious Diseases. 2008;197(2):266–269. (22) Larena M, Regner M, Lobigs M. The Chemokine Receptor CCR5, a Therapeutic Target for HIV/AIDS Antagonists, Is Critical for Recovery in a Mouse Model of Japanese Encephalitis. PLoS ONE. 2012;7(9). (23) de Faria GM, Ayo CM, de Oliveira AP, Lopes AG, Frederico FB, Silveira‑Carvalho AP et al. CCR5 chemokine receptor gene polymorphisms in ocular toxoplasmosis. Acta Trop. 2018;178:276–280. (24) Ryder SP. #CRISPRbabies: Notes on a Scandal. Crispr Journal. 2018;1(6):355–357. (25) Krimsky S. Ten ways in which He Jiankui violated ethics. Nature Biotechnology. 2019;37(1):18–20.

Zdroj: MT