Transplantace a regenerace Langerhansových ostrůvků v léčbě diabetu

Diabetes mellitus je dnes nejčastější příčinou chronické nedostatečnosti ledvin, slepoty získané v dospělosti, netraumatických amputací a těžkých forem neuropatie. Je proto zcela nezbytné hledat nové formy terapie, které by dokázaly dosáhnout dlouhodobé normalizace glykémie. V případě diabetu dnes již standardně navozuje dlouhodobou normoglykémii orgánová transplantace pankreatu, která se vzhledem k rizikům imunosupresivní léčby provádí zejména v kombinaci s transplantací ledviny. Podstatně méně invazivní alternativu představuje v posledních několika letech transplantace izolovaných Langerhansových ostrůvků. Počet vhodných pacientů, kteří by z tohoto způsobu léčby mohli pro- fitovat, však mnohonásobně převyšuje dostupnost vhodných orgánů k transplantaci. Hledají se proto nové možnosti získání buněčných linií produkujících inzulin, a to buď ze zvířecí tkáně, nebo především z embryonálních či dospělých kmenových buněk. Nově se studuje také možnost in vivo regenerace endogenních či transplantovaných beta buněk pankreatu. V Institutu klinické a experimentální medicíny (IKEM) v Praze je v současné době zavedena metoda orgánové transplantace pankreatu, dále byl zahájen program transplantace izolovaných ostrůvků a studuje se možnost propagace buněčných linií produkujících inzulin.

Rozhodující úlohu při vzniku pozdních komplikací diabetu má dlouhodobá hyperglykémie. Potvrdila to studie DCCT – Diabetes Control and Complications Trial (The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long‑term complications in insulin‑dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N Engl J Med. 1993;329:977–86; Nathan D M, Cleary P A, Backlund J Y, et al. Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes. N Engl J Med. 2005;353:2643–53), když se ve skupině pacientů s diabetem 1. typu léčených tzv. intenzifikovaným inzulinovým režimem podařilo oproti kontrolní skupině léčené konvenčně výrazně snížit a oddálit projevy retinopatie, nefropatie i polyneuropatie a ischemické choroby srdeční. Diabetes mellitus 1. typu postihuje v západní společnosti asi čtyři promile obyvatel a navození dlouhodobě normálních hodnot (dlouhodobé normoglykémie) by pro jejich zdraví a kvalitu života mělo zásadní význam.

Bohužel, ani intenzifikovaná inzulinová léčba založená na pečlivé edukaci nemocného, pravidelném samostatném monitorování glykémií a aplikaci inzulinu ve více denních dávkách nedokáže kolísající hladiny krevního cukru normalizovat a je navíc pro pacienta technicky náročná, nákladná, zvyšuje riziko těžkých hypoglykemických příhod a je pro svoji obtížnost mnohdy nepřijatelná. Do nedávné doby představovala jedinou metodu, která dokáže dlouhodobě navodit normoglykémii a nezávislost na zevním inzulinu, orgánová transplantace pankreatu. V posledním desetiletí se stala standardním způsobem léčby pacientů s diabetem 1. typu, kteří současně trpí renální insuficiencí, a kombinuje se zpravidla také s transplantací ledviny. Pacient tak je nejen zbaven dialýzy, ale současně mu nemusí být dále podáván inzulin, nehrozí mu hypoglykémie a má uvolněnou dietu. Vznikají tedy předpoklady pro to, aby dále nepostupovaly chronické cévní změny, které diabetes provázejí. Kombinovaných transplantací ledviny a pankreatu se ve světě provádí asi 1 800 ročně (dvě třetiny v USA), v České republice asi 25, přičemž pětileté přežívání štěpů pankreatu činí přibližně 76 % (Saudek F, Bouček P, Kožnarová R, Lipár K, Janoušek S, Vlasáková Z, Lánská V, Bartoš V. 300 transplantací pankreatu v Institutu klinické a experimentální medicíny v Praze. Praktický Lékař. 2007 /v tisku/). graf kumulativního přežívání funkce štěpu pankreatu (normoglykémie bez potřeby exogenního inzulinu) u kombinovaných transplantací pankreatu a ledviny provedených v IKEM v letech 2001 až 2006 ukazuje obr. 1. Pro srovnání je znázorněna křivka přežívání zaznamenaná ve srovnatelném období v transplantačních centrech v USA (podle mezinárodního registru transplantací pankreatu).

Samostatně se transplantace pankreatu provádí mnohem méně často. V IKEM podstoupilo takovou operaci zatím třiatřicet osob. Kromě toho, že pacienti musí po transplantaci trvale užívat imunosupresivní léčbu, přináší tento výkon stále ještě nezanedbatelné chirurgické riziko. Asi 5 až 10 % štěpů musí být později odstraněno pro trombózu cév nebo akutní zánět a asi ve třiceti procentech případů je nutná reoperace pro krvácení, hromadění tekutiny v okolí štěpu či pro únik pankreatické šťávy.

Transplantace izolovaných Langerhansových ostrůvků

Alternativním přístupem náhrady endokrinní funkce pankreatu je proto transplantace izolovaných Langerhansových ostrůvků. Proti orgánové transplantaci je totiž jen minimálně invazivní a připouští možnosti navození specifické imunologické tolerance a neomezené dostupnosti tkáně k transplantaci s použitím metod xenotransplantace a genetického inženýrství. Mohla by tak v budoucnu být dostupná pro velké množství pacientů a díky své bezpečnosti by mohla být použita jako metoda preventivní již v časném stadiu diabetu.

V roce 2000 kanadští vědci z Edmontonu publikovali výsledky série transplantací ostrůvků u sedmi příjemců, kteří (všichni) mohli ukončit dlouhodobou léčbu inzulinem alespoň na jeden rok. Ve srovnání s předchozími údaji – 8 % nezávislosti na inzulinu – to znamenalo mimořádný úspěch, jenž byl připisován zlepšené izolační technice, infuzi velkého množství čerstvě připravených ostrůvků, vynechání terapie kortikoidy, použití jen malých dávek tacrolimu (který může tlumit sekreci inzulinu) a použití sirolimu jako základního imunosupresiva (Shapiro A M, Lakey J R, Ryan E A, et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid‑free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 2000;343:230–8). Protože celosvětově se transplantací ostrůvků provádí zatím málo, vyhodnocuje výsledky transplantací provedených v USA a Kanadě od roku 2001 tzv. Collaborative Islet Transplant Registry (CITR). Ten zatím ukázal, že transplantace ostrůvků může být přínosná pro vybrané pacienty s labilním diabetem, kteří trpí výraznou poruchou rozpoznávání hypoglykémie a mají značně sníženou kvalitu života, i když úspěšnost je všeobecně nižší než v původní edmontonské sérii. V roce 2005 bylo v Edmontonu léčeno již více než 65 příjemců, kteří podstoupili jednu až tři ostrůvkové transplantace. Nezávislosti na inzulinu se podařilo dosáhnout po prvním roce u čtyřiačtyřiceti z nich (68 %). Bohužel většina příjemců potřebovala v následujících letech určitou dávku inzulinu a po pěti letech se bez něj obešlo pouze 5 % léčených (Ryan E A, Paty B W, Senior P A, et al. Five‑year follow‑up after clinical islet transplantation. Diabetes. 2005;54:2060–9). Klinicky významná produkce C‑peptidu však byla zachována u 80 % léčených, což se projevilo stabilizací diabetu s téměř normálními hodnotami glykovaného hemoglobinu, eliminací hypoglykemických stavů a zlepšením kvality života.

S použitím tzv. „edmontonského protokolu“ a jeho modifikací bylo do současné doby léčeno již více než 600 osob na celém světě, a i když v mnoha případech nelze ukončit léčbu inzulinem, výsledky lze považovat za velký úspěch, a to navzdory možným komplikacím. Ty nejsou podle CITR stále vzácné, i když většinou nemají dlouhodobé následky a jejich závažnost není srovnatelná s komplikacemi orgánové transplantace. Zlepšení implantační techniky vedlo téměř k eliminaci významnějšího krvácení či trombózy portálních větví, ale dlouhodobá imunosuprese stále představuje riziko. Nejzávažnější mohou být progrese nedostatečnosti ledvin, vyvolané podáváním kalcineurinových inhibitorů, a infekce způsobené trvalým tlumením imunity. V sérii 36 pacientů léčených v rámci ověřování edmontonského protokolu v devíti předních světových centrech byl zaznamenán průměrný pokles glomerulární filtrace o 5 ml/min ročně, což vede zejména k úvahám o změně imunosupresivního schématu s vyloučením neurotoxických látek (Shapiro A M, Ricordi C, Hering B J, et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. N Engl J Med. 2006;355:1318–30). Neoplastická onemocnění po transplantaci ostrůvků nebyla zatím zaznamenána, ale je nutno s touto možností počítat. Proto je nyní v centrech, která jsou schopna kvalitně izolovat ostrůvky, transplantace ostrůvků indikována jen u vysoce selektovaných pacientů, u nichž riziko dalšího průběhu diabetu převažuje nad riziky transplantace nebo kteří již imunosupresivní léčbu z důvodu jiné současné transplantace stejně užívají. Protože izolace ostrůvků je techniky náročná a vyžaduje špičkové vybavení a zkušenost, existují nyní v USA i v Evropě sítě pracovišť, která zajišťují zpracování pankreatu a samotné ostrůvky pak zasílají zpět do jednotlivých center.

V pražském IKEM je nyní na čekací listině deset osob a transplantace ostrůvků již byla provedena osmkrát. U čtyř z pěti léčených osob se podařilo významně snížit dávky inzulinu na 30 až 10 % původní dávky a dosáhnout téměř normálních hodnot glykovaného hemoglobinu. V jednom případě byla provedena kombinovaná transplantace jater a ostrůvků od téhož dárce. ostrůvky byly izolovány v průběhu operace příjemce a před uzavřením dutiny břišní byly jednoduchým způsobem inundovány přímo do vena portae. V ostatních případech byl pod radiologickou kontrolou bez celkové anestezie zaveden katetr do portálního řečiště. Dosavadní výsledky jsou znázorněny na obr. 2. U tří diabetiků 1. typu s původně nulovou produkcí inzulinu bylo dosaženo jeho klinicky významné produkce (posuzováno podle hladiny C‑peptidu).

Pozitivní zkušenosti s transplantacemi ostrůvků však přinesly také nové otázky. Izolační proces je totiž stále málo efektivní a získat se podaří většinou méně než třetinu ostrůvků přítomných v pankreatu, které mohou být navíc funkčně poškozeny, jsou vystaveny nefyziologickému prostředí v jaterní tkáni, kam se implantují, mají omezené nebo žádné regenerační schopnosti a působí na ně toxicky většina používaných imunosupresivních léků. Potvrdí‑li se tedy úspěšnost ostrůvkové transplantace v širším měřítku, zůstane tento způsob léčby nadále nedostupný pro většinu osob, které by z ní mohly mít prospěch. Zpravidla je k navození normoglykémie nutno zpracovat dvě až tři slinivky a zatím jsou k transplantaci užívány ostrůvky z každého třetího až čtvrtého orgánu, který je zpracován.

Budoucnost v tkáňovém inženýrství?

Dostatek ostrůvků nebo čistých beta buněk by mohl být získán z pankreatu zvířat, nejspíše prasat. I když genetické inženýrství dovolilo modifikovat některé hemokoagulační a imunogenetické vlastnosti vyvolávající hyperakutní rejekci a izolované ostrůvky lze ukládat do semipermeabilních kapslí, zůstává transplantační bariéra mezi člověkem a prasetem zatím nepřekonaná (Ibrahim Z, Busch J, Awwad M, Wagner R, Wells K, Cooper D K. Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems. Xenotransplantation. 2006;13:488–99).

Nadějnější se proto zatím zdá příprava tkáně z definovaných buněčných linií, které by bylo možno produkovat in vitro. Jako možný zdroj se testují embryonální kmenové buňky, dospělé kmenové buňky pankreatu, hematopoetické kmenové buňky a buňky jiných tkání, které jsou schopny transdiferenciace (Koblas T, Harman S M, Saudek F. The application of umbilical cord blood cells in the treatment of diabetes mellitus. Rev Diabet Stud. 2005;2:228–34). V řadě laboratoří včetně naší (Koblas T, Zacharovová K, Berková Z, Mindlová M, Girman P, Dovolilová E, Saudek F. Isolation and characterisation of human Cxcr4 positive pancreatic cells. Acta Biologova. 2007 /v tisku/) se podařilo v samotných ostrůvcích a tkáni pankreatických vývodů identifikovat buňky, které jsou schopny po příslušené modifikaci v tkáňové kultuře v určité míře produkovat inzulin v závislosti na okolní koncentraci glukózy. Tato schopnost je však ve srovnání s nativními beta buňkami malá, po transplantaci se často ztrácí a navíc existuje riziko jejich maligní přeměny. Působením růstových faktorů je také možno dosáhnout určité míry transdiferenciace jaterních buněčných linií, které jsou schopny produkovat inzulin. Pro experimenty in vitro a u hlodavců byly získány i komplexně modifikované linie s umělým genetickým konstruktem produkce inzulinu, jež jsou potenciálně imortalizovány a lze jich získat větší množství. Žádný z těchto uvedených postupů však nebyl zatím testován u člově‑ ka a nelze v nejbližších několika letech očekávat jejich klinické uplatnění. Nedostatkem – ve srovnání s beta buňkou – zůstává relativně malá produkce inzulinu, její nedostatečná kontrola a postupné vyhasínání. Získané buňky mohou také in vivo ztrácet svoji genotypickou stabilitu a měnit se v buňky maligní. Pokud by se jednalo o tkáň alogenní, budou nadále potřebné další modifikace, které by zabránily odhojení, nebo bude transplantaci třeba doprovázet imunosupresivní léčbou (Ouziel‑Yahalom L, Zalzman M, Anker‑Kitai L, et al. Expansion and redifferentiation of adult human pancreatic islet cells. Biochem Biophys Res Commun. 2006;341:291–8). obr. 3 z naší laboratoře ukazuje, že z exokrinní tkáně pankreatu je možno získat buněčné linie, které nesou některé znaky dospělých kmenových buněk pankreatu (viz obr. 3a). Po stimulaci růstovými a diferenciačními faktory formují některé tyto buňky shluky připomínající ostrůvky, které produkují C‑peptid (viz obr. 3b). V následných studiích bude testována schopnost těchto artificiálních ostrůvků léčit experimentální diabetes.

Regeneraci by mohly napomoci léky

Další možnost také představuje léčba samotného autoimunitního procesu, který je příčinou vzniku diabetu 1. typu. V časném klinickém stadiu jsou ostrůvky ještě částečně zachovalé a v případě, že by se podařilo zastavit jejich další destrukci, mohly by spontánně či farmakologickou stimulací regenerovat. Dlouhodobá imunosupresivní léčba má určitý příznivý vliv na částečné zachování endogenní produkce inzulinu, ale efekt je vyvážen nepříznivými účinky léků. Naproti tomu nárazová biologická léčba zaměřená proti určitým populacím T‑lymfocytů, které mohou být efektory autoimunitního procesu, měla v několika studiích překvapivý účinek, který pravděpodobně souvisel také s indukcí regulačních T‑lymfocytů, navozujících částečnou toleranci vůči autoantigenům. V americké a nezávislé evropské studii byly použity humanizované monoklonální protilátky proti CD3 antigenu (Herold K C, Gitelman S E, Masharani U, et al. A single course of anti‑CD3 monoclonal antibody hOKT3gamma1(Ala‑Ala) results in improvement in C‑peptide responses and clinical parameters for at least 2 years after onset of type 1 diabetes. Diabetes. 2005;54:1763–9; Keymeulen B, Vandemeulebroucke E, Ziegler A G, et al. Insulin needs after CD3‑antibody therapy in new‑onset type 1 diabetes. N Engl J Med. 2005;352:2598–608), podávané po dobu deseti dnů. V obou případech měla skupina léčená aktivní látkou jeden rok po zahájení léčby prokazatelně vyšší produkci C‑peptidu a potřebovala proti skupině léčené placebem nižší dávky inzulinu. Velmi podobné výsledky přinesla i dosud pokračující studie česká, při které byl podáván polyklonální anti‑T‑lymfocytární globulin (Saudek F, Havrdová T, Bouček P, Karasová L, Novota P, Skibová J. Polyclonal anti‑T‑cell therapy for type 1 diabetes mellitus of recent onset. Rev Diabet Stud. 2004;1:80–8). Je pravděpodobné, že efekt by mohl být výraznější, pokud by léčba mohla být zahájena ještě časněji, než dojde k destrukci převažující části beta buněk. K tomu by však byla nutná přesnější diagnostika autoimunitního procesu na úrovni detekce autoreaktivních klonů T‑buněk, která zdaleka nemusí korelovat s výskytem autoprotilátek typu anti‑gAD, IA2 či proti inzulinu. Reproducibilní testy takového typu však nejsou dosud k dispozici. Regeneraci endogenních či transplantovaných ostrůvků by mohly podpořit některé nové léky označované jako inkretiny, které se nyní začínají používat v léčbě diabetu 2. typu. Jedná se zejména o analoga glukagon‑like peptidu 1 (gLP‑1), která v experimentu nejen stimulují sekreci inzulinu, ale vedou také ke zvětšování ostrůvků a částečně k jejich neogenezi. Dalším aktuálním úkolem je vyvinutí metod umožňujících navození imunologické tolerance vůči ostrůvkům, která by dovolila skončení imunosupresivní léčby při alogenní transplantaci a zamezila by další endogenní destrukci nově implantovaných nebo regenerovaných ostrůvkových buněk.

Zda některá z uvedených metod přípravy tkáně produkující inzulin in vitro bude užitečná v klinické praxi, nelze ještě říci. V krátkodobé perspektivě buněčné terapie diabetu lze očekávat vývoj šetrnějších metod izolace lidských Langerhansových ostrůvků, lepší uchování jejich vitality a dosažení jejich regenerace po transplantaci.

Plnou verzi článku najdete v: Medical Tribune 19/2007, strana C4

Zdroj: