Nové obzory molekulární patologie zhoubných nádorů aneb proč HER2– není vždy negativní a proč BRCA+ sama o sobě nestačí

Nepřesné stanovení imunohistochemického skóre může až 85 procent pacientek s karcinomem prsu s nízkou expresí HER2 předem diskriminovat ze studií s novými léky, které jsou určeny právě jim. A jiný příklad – pokud by se rutinně testovaly pouze mutace BRCA, přibližně 40 procent pacientek s ovariálním karcinomem by se nedostalo k účinné léčbě. To jsou ve stručnosti jen dvě z mnoha výzev, o nichž se vedla diskuse během letošního Evropského patologického kongresu.

V úvodu sympozia konaného 29. srpna s podporou společností AstraZeneca a Daiichi‑Sankyo připomněl prof. Giuseppe Viale z Università degli Studi di Milano, Itálie, že hodnocení karcinomu prsu podle imunohistochemického (IHC) skóre exprese receptoru 2 pro lidský epidermální růstový faktor (HER2) je v praxi postaveno na dichotomii pozitivní vs. negativní. HER2 pozitivní jsou nádory s IHC skóre 3+, resp. také 2+ (nejednoznačné), pokud je u nich následnou hybridizací in situ (ISH) potvrzena závislost na amplifikaci genu (tedy 2+/ISH pozitivní). Za HER2 negativní se považují nádory s IHC skóre 0, 1+ a také 2+/ISH negativní, tedy bez amplifikace.

Uvedené binární dělení bylo v době svého vzniku motivováno především klinickou a také ekonomickou potřebou stanovit indikační kritérium pozitivity (IHC skóre 3+ a 2+/ISH‑pozitivní) jako předpoklad odpovědi na léčbu trastuzumabem, monoklonální protilátkou proti HER2. Vše ostatní bylo bráno jako nádory HER2 negativní, pro které neexistovala specifická léčba – nebyl proto důvod ani rozlišovat od sebe nádory s IHC skóre 0 a 1+, ani se podrobněji zabývat nálezy IHC skóre 2+/ISH negativními.

Vývoj nových molekul a konjugátů monoklonálních protilátek, ze kterých by mohlo profitovat více pacientek s karcinomem prsu, si pravděpodobně vynutí změnu stávajícího stavu dělení nádorů podle stavu HER2. Jako nová kategorie se objevuje tzv. HER2 low, zahrnující nádory s nízkou expresí HER2 nezávislou na onkogenu (IHC skóre 1+ a 2+/ISH negativní), na které nové léky primárně cílí.

Smrákání nad binárním modelem HER2 pozitivity/negativity

Prof. Frédérique Penault‑Llorcová, ředitelka Centre Jean Perrin, Clermont‑Ferrand, Francie, připomněla aktuálně platná společná doporučení American Society of Clinical Oncology a College of American Pathologists (ASCO/CAP) z r. 2018. Uvádí se v nich, že pro vyšetření stavu HER2 je třeba provést sekvenční testování nejprve imunohistochemicky na úrovni proteinu. V případě pozitivity nebo nejednoznačného nálezu skóre 2+ svědčícího o pravděpodobné přítomnosti diskordantního fenotypu (IHC negativní/ISH pozitivní) provést následné ověření na úrovni DNA pomocí ISH.

Nádor je imunohistochemicky potvrzen jako HER2 pozitivní, pokud:

• barvení membrány je po obvodu buňky kompletní a intenzivní a je přítomno u > 10 procent nádorových buněk (IHC skóre 3+).

Nádor je imunohistochemicky potvrzen jako HER2 negativní, pokud:

• barvení membrány je nekompletní, slabé/sotva patrné a je přítomno u > 10 procent nádorových buněk (IHC skóre 1+) nebo
• není patrné žádné barvení nebo je barvení membrány nekompletní, slabé/sotva patrné a je přítomno u ≤ 10 procent nádorových buněk (IHC skóre 0).

Nádor je imunohistochemicky nejednoznačný, pokud je u > 10 procent nádorových buněk barvení membrány po obvodu buňky kompletní, ale s intenzitou slabou/střední, nebo kdy je u > 10 procent nádorových buněk barvení membrány nekompletní, ale s intenzitou silnou/střední (IHC skóre 2+). Poté následuje reflexní testování téhož vzorku metodou ISH nebo nový test IHC nebo ISH nového vzorku, pokud je dostupný.

Od dalšího přednášejícího, prof. Rüschoffa, si prof. Penault‑Llorcová vypůjčila jeho praktický nástroj, tzv. pravidlo mikroskopování. Začíná se vždy s nejmenším zvětšením. Je‑li barvení membrány viditelné při pětinásobném zvětšení (a často už i pouhým okem), jedná se o IHC skóre 3+. Vyžaduje‑li posouzení barvení střední zvětšení, tedy 10–20násobné, pak je IHC skóre 2+. A při nutnosti použít vysokého, až 40násobného zvětšení jde o IHC skóre 1+ (viditelné barvení) nebo 0 (barvení není ani při tomto zvětšení patrné) – odlišit v tomto případě jedno od druhého, tedy „slabé/sotva patrné“ barvení od „žádného“, je však podle prof. Penault‑Llorcové v praxi i při vysokém zvětšení poměrně obtížné. Ale jak už bylo řečeno, donedávna na tom podle ní až tolik nezáleželo, protože z hlediska terapeutických možností nebyl mezi nádory s IHC skóre 0 a 1+ žádný klinicky využitelný rozdíl. Ale s příchodem studií léčby zacílené na nádory s nízkou expresí HER2 se situace začíná měnit.

Prof. Penault‑Llorcová v této souvislosti připomněla starší práci (Lambein et al., Am J Clin Pathol 2013), podle které ze 102 karcinomů prsu hodnocených z hlediska exprese HER2 na lokální úrovni jako IHC skóre 0 jich centrálním hodnocením bylo jako skutečně 0 potvrzeno pouhých 15 – zbývajících 87 vzorků bylo přehodnoceno na IHC skóre 1+ nebo 2+. „Dnes by takové neodlišení vzorků s IHC skóre 0 od 1+ či 2+ znamenalo, že bychom předem znemožnili 85 procentům pacientek s karcinomem prsu s nízkou expresí HER2 vstoupit do studie s novými léky, které jsou určeny právě pro jejich typ nádoru,“ zdůraznila prof. Penault‑Llorcová. Ostatně, ne zcela zřetelná hranice mezi nálezy IHC 0 a 1+ je podle ní i důvodem, proč v literatuře variují údaje o výskytu HER2 IHC skóre 0 mezi 14 až 80 procenty.

• skupina 1 – pokud je poměr počtu signálů genu a signálů pericentromerické oblasti chromozomu 17 (HER2/CEP17) ≥ 2,0 a průměrný počet kopií HER2 ≥ 4,0 signálů na buňku, pak je výsledek ISH pozitivní (s amplifikací genu);
• skupina 5 – pokud je HER2/CEP17 < 2,0 a průměrný počet kopií HER2 < 4,0 signálů na buňku, pak je výsledek ISH negativní (bez amplifikace genu).

Mezi těmito dvěma krajními póly se nalézají další tři skupiny:

• skupina 2 – pokud je HER2/CEP17 ≥ 2,0 a průměrný počet kopií HER2 < 4,0 signálů na buňku, výsledek je ISH negativní;
• skupina 3 – pokud je HER2/CEP17 < 2,0 a průměrný počet kopií HER2 ≥ 6,0 signálů na buňku, výsledek je ISH pozitivní;
• skupina 4 – pokud je HER2/CEP17 < 2,0 a průměrný počet kopií HER2 mezi 4,0 a 6,0 signálů na buňku, výsledek je ISH negativní.

Z toho, co bylo řečeno o nově zvažované kategorii HER2 low, vyplývá, že bude‑li se ve skupině 2, 4 a 5 nacházel vzorek skórovaný imunohistochemicky jako 1+ nebo 2+, výsledek nebude HER2 negativní, ale právě HER2 low. Prof. Penault‑Llorcová odhaduje, že by takových nádorů s nízkou expresí HER2, která není závislá na stavu onkogenu, mohlo být až 55 procent všech karcinomů prsu, jež by bylo možno v budoucnu léčit novými anti‑HER2 přípravky, např. již zmíněnými konjugáty monoklonálních protilátek. Mimochodem, do národních doporučení publikovaných v letošním roce francouzští patologové již jako jedni z prvních na světě novou kategorii HER2 low zanesli a řadí do ní nádory původně HER2 negativní s IHC skóre 1+ a 2+ bez ISH potvrzené amplifikace genu (průměrný počet kopií HER2 < 4,0 signálů nebo ≥ 4,0 až < 6,0 signálů, resp. HER2/CEP17 ≥ 2).

Pro vytvoření lepší představy o skutečném výskytu karcinomů prsu s nízkou expresí HER2 byla zahájena globální neintervenční retrospektivní studie RetroBC‑HER2L k posouzení archivovaných vzorků tkáně a zdravotních záznamů pacientek s metastatickým karcinomem prsu klasifikovaným jako HER2 negativní (IHC 0, 1+ a 2+/ISH negativní) léčených mezi lednem 2015 a prosincem 2017. Primárním cílem je v uchovaných vzorcích identifikovat, kolik případů by bylo podle nové klasifikace HER2 low a jaké u nich byly výsledky tehdejší standardní léčby.

Digitální patologie, RNA, proteomika – co pomůže lépe najít HER2 low?

Prof. Josef Rüschoff z Targos Molecular Pathology GmbH a Pathologie Nordhessen, Kassel, SRN, který již byl v průběhu sympozia zmíněn v souvislosti s pravidlem mikroskopování, se ve svém příspěvku zamyslel nad současností a budoucností testování HER2.

Má‑li v budoucnu více pacientek s HER2 low karcinomem prsu profitovat z moderní léčby, bude nutné je v praxi dobře identifikovat. To podle prof. Rüschoffa znamená začít již od pečlivé přípravy vzorku v preanalytické fázi, včetně jeho správné fixace. Neméně důležité je najít takové technologie, které pomohou s objektivním hodnocením vzorků, zejména na rozhraní IHC skóre 0 a 1+, ale i 2+ a 3+, k identifikaci HER2 low nádorů a nahradí dnešní semikvantitativní a subjektivní hodnocení typu „intenzivní“, „slabý“, „sotva patrný“…

Jak připomněl prof. Rüschoff, v letech 2000–2010 byly vyvinuty první digitální analyzátory obrazu, jejichž užití bylo schváleno i lékovými agenturami. Jejich slabinou však zatím je, že oblasti zájmu analyzovaného vzorku musejí být i nadále předem vybírány a označeny patologem. Např. systém Aperio ImageScope vyžaduje výběr 15–20 oblastí, aby v nich bylo obsaženo 1 000 nádorových buněk. Jedná se tedy stále o částečně subjektivní analýzu obrazu.

V posledním desetiletí byl učiněn další krok kupředu, a to díky příchodu umělé inteligence a analýzy založené na algoritmech. Tyto plně autonomní systémy mají schopnost učit se a podle prof. Rüschoffa díky nim klesá možnost subjektivního ovlivnění výsledku, protože role lidského faktoru v celém procesu se snižuje na minimum. Jedním z prvních takových analyzátorů obrazu je samoučící se a adaptibilní Visiopharm Integrator System. Hodnotí celý snímek, nejen předem vybrané oblasti zájmu, automaticky detekuje nádorovou tkáň a odliší ji od zdravé a expresi HER2 nehodnotí jen podle intenzity barvení, ale bere v úvahu i strukturu membrány a její konektivitu. Další výhodou je detekce heterogenity a její kvantitativní vyhodnocení.

Další možností je využít v molekulárním testování RNA, např. pro reverzní transkripci PCR (RNA‑RT/PCR). Prof. Rüschoff připomněl, že konkordance testování HER2 mezi DNA‑ISH a RNA‑RT/PCR je vysoká, až 97 procent. Na druhé straně falešná negativita testu Oncotype DX RT‑PCR pro HER2 je vyšší než 50 procent, protože metoda je citlivá na kontaminaci vzorku zdravou tkání. Potenciál zejména pro detailnější klasifikaci HER2 nejasných případů má i metoda RNAscope in situ.

Podle prof. Rüschoffa se nabízí i řada dalších hi‑tech přístupů. Např. analýza proteomu ze vzorků séra pacientek s karcinomem prsu identifikovala 2 200 proteinů, z nichž 103 bylo odlišně exprimováno u HER2 negativního onemocnění oproti HER2 pozitivnímu – 43 méně, popř. nebyly detekovatelné, 60 naopak více. Mezi nimi se ukázal být jako vedoucí Calpain 10, protein, který štěpí extracelulární doménu receptoru HER2 a ponechává intaktní jeho intracelulární doménu. „To znamená, že až 15 procent nádorů klasifikovaných jako HER2 low nebo HER negativní má stále aktivní intracelulární receptorovou doménu HER2 a může se chovat odlišně od nádorů, u kterých receptor HER2 kompletně absentuje,“ zdůraznil prof. Rüschoff, podle nějž se proto může lišit třeba přirozený průběh choroby či odpověď na léčbu. Extracelulární doména receptoru HER2 detekovaná v séru by se spolu se zvýšenou koncentrací Calpainu 10 mohly stát biomarkery pro monitoring účinku léčby či pro časnou detekci relapsu.

Pro sledování léčebné odpovědi a volbu správného terapeutického cíle (nikoli pro časnou diagnostiku) je podle prof. Rüschoffa vhodná také tekutá biopsie. Nejen cirkulující nádorová DNA, ale i další ukazatele, např. signatura miRNA, může dobře predikovat úspěšnost anti‑HER2 cílené léčby (Li et al., Nat Commun 2018, ověřil tuto souvislost u trastuzumabu).

Porucha homologní rekombinace jako fenotyp

Dr. Anders Edsjö z Lunds universitet, Švédsko, úvodem druhého sympozia (30. srpna, s podporou společností AstraZeneca a MSD) připomněl, že homologní rekombinace je klíčovým procesem opravy dvouřetězcových zlomů DNA, při kterém probíhá výměna částí DNA mezi dvěma homologními chromozomy, syntéza chybějících úseků a následné scelení zlomu. Pokud je funkce homologních rekombinačních oprav narušena, uplatňují se místo ní jiné, méně precizní mechanismy reparace – přímé nehomologní spojování volných konců (NHEJ) nebo mikrohomologií zprostředkované spojování konců (MMEJ), jejichž výsledek je však náchylný k chybám.

Za vznikem poruchy homologní rekombinace (homologous recombination deficiency, HRD) stojí mj. inaktivace tumor supresorových genů BRCA1 a BRCA2, které ve zdravé buňce kódují proteiny vazebného komplexu DNA. Pokud jsou vyřazeny z činnosti, je narušena kontrola buněčného cyklu a buňky při každém dalším dělení akumulují genetické chyby s rizikem vzniku malignity. Důsledkem absence aktivity BRCA 1/2 je i vyřazení dalších genů spouštějících v případě poškození DNA buněčnou apoptózu.

Jak dále zrekapituloval dr. Edsjö, nádorové buňky s HRD jsou zároveň vnímavé vůči narušení jiných, nezávislých mechanismů oprav poškozené DNA, především tzv. excizní opravy bází (base excision repair, BER) u jednořetězcových zlomů. Klíčovou roli v tomto procesu oprav má enzym poly(ADP‑riboso) polymeráza (PARP). Jeho inhibice má za následek, že jednořetězcové zlomy DNA zůstávají neopravené, přecházejí do zlomů dvouřetězcových, které není buňka s poruchou homologní rekombinace schopna efektivně opravit, a dochází k rozvoji její genomové nestability. Na tomto principu je postaven koncept tzv. syntetické letality – kombinace deficitu dvou a více genů vedoucí k buněčné smrti.

Porucha homologní rekombinace je u některých typů zhoubných nádorů fenotypem – u žen u karcinomu prsu a ovarií, u mužů karcinomu prostaty a mléčné žlázy, u obou pohlaví pak např. karcinomu pankreatu.

Dr. Edsjö na fenotypu ovariálního karcinomu demonstroval, že na poruchách homologní rekombinace se nepodílejí jen mutace BRCA (somatické i germinální společně asi u 20 procent z nich, u 10 procent metylace promotoru BRCA1), ale i jiné alterace. Nádory bez prokázané zárodečné mutace BRCA1/2, které ale svou patologií i klinickými projevy uvedené nádory připomínají, jsou označovány jako BRCAness.

Z toho, jak uvedl dr. Edsjö, vyplývá, že rutinní testování založené na genotypizaci a nalezení defektního genu (BRCA 1/2, ev. dalších genů homologních rekombinačních oprav) nezachytí v celé šíři nádory s HRD. Pozornost se tedy soustředí na hodnocení genomové nestability. Americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) již byly schváleny dva testy, které využívají odlišných kritérií záchytu. FoundationOne CDx je založen na detekci ztráty heterozygozity, Myriad myChoice CDx se soustředí na tři strukturní místa genetické alterace a určuje skóre genomové instability součtem ztráty heterozygozity v relevantních regionech (LOH), počtu telomerových alelických imbalancí (NtAI) a rozsáhlých přestaveb (LST).

Dr. Edsjö jmenoval také metodu hybridizačních čipů SNP array založenou na detekci jednonukleotidových polymorfismů na principu hybridizace oligonukleotidových sond, dále celogenomové sekvenování, cílené sekvenování (celého exomu nebo panelu genů) a vyšetřování mutačních vzorů (signatur) – např. testem HRDetect.

Pro testování jsou vhodné v první řadě parafínové bločky s formalinem fixovanou tkání (FFPE), mezi jejich výhodami dr. Edsjö uvedl dostupnost a dostatečný obsah nádorové tkáně s přehledem o morfologii, nevýhodami však jsou možná fragmentace a modifikace DNA, potenciálně nedostatečné množství materiálu, invazivita při odběru a limitované možnosti rebiopsie. Druhou možností je vyšetření z krve s dostatečnou kvalitou i kvantitou DNA, detekuje ovšem pouze vrozené mutace. Někde mezi oběma typy vzorků co do výtěžnosti a spolehlivosti podle něj leží čerstvě zmražená tkáň (FF). Kvalita takto získané DNA je vysoká, zmražené vzorky jsou však složité na logistiku a mohou nastat i obtíže s hodnocením obsahu nádorové buňky. K rozvíjejícím se metodám získávání vzorku pak nepochybně patří tzv. tekutá biopsie s vyšetřením nádorové DNA cirkulující v krevním oběhu (ctDNA). Metoda je minimálně invazivní a při jednom odběru je zachycena nádorová DNA z více lokalit. Je ovšem zatížena fragmentací vzorku v důsledku záchytu různých frakcí ctDNA a klonální hematopoezy.

Účinek inhibice PARP i u HRD‑pozitivních ovariálních karcinomů bez mutace BRCA

Prof. Thomas McKee z Hôpitaux Universitaires de Genève, Švýcarsko, zrekapituloval, že genomické alterace vystavují buňky pozitivní, ale i negativní selekci a jsou základem karcinogeneze. Některé jsou svým rozsahem malé, postihující jednotlivé nukleotidy, s rozpoznatelným charakteristickým mutačním rysem (signaturou). Jako příklad uvedl působení UV záření a s ním související známou záměnu cytosinu za thymidin.

Jindy se ale může jednat o širší postižení zasahující celé segmenty genomu, např. právě jako důsledek poruchy homologní rekombinace. U nádorů s nově vzniklou HRD se přitom podle profesora McKeeho nemusí jejich mutační signatura při testování nutně zobrazit.

Cíle onkologické léčby se donedávna soustředily na konkrétní genetické alterace (zajímavostí, která na sympoziu zazněla, je, že většina cílených léků až dosud nějakým způsobem souvisela s růstovými faktory a jejich receptory). V poslední době se cílem stávají i celé genomové signatury, např. mikrosatelitová nestabilita.

Léčba ovariálního karcinomu s HRD (nikoli tedy nutně jen BRCA1/2 pozitivního) je založena na inhibici PARP a navození syntetické letality. Prof. McKee shrnul vše, co bylo až dosud na sympoziu o této problematice řečeno, lapidárně. PARP je základem opravy jednořetězcových zlomů DNA. Pokud v důsledku inhibice PARP nemůže být tento zlom opraven, degraduje do dvouřetězcového zlomu DNA. Při léčbě inhibitory PARP pak buňky schopné homologní rekombinace provedou efektivní opravu tohoto dvouřetězcového zlomu, zatímco buňky neschopné homologní rekombinace zahájí opravu přes NHEJ nebo MMEJ s následnou genomickou instabilitou a buněčnou smrtí.

Důkazy pro to existují z řady klinických studií, prof. McKee si vybral randomizovanou, dvojitě zaslepenou studii fáze III PAOLA‑1. Byly do ní zařazeny pacientky s nově diagnostikovaným pokročilým high‑grade ovariálním karcinomem a odpovědí na prvoliniovou chemoterapii platinou/taxany plus bevacizumabem. Byly randomizovány v poměru 2 : 1 k podávání buď inhibitoru PARP olaparibu, nebo placeba v udržovací léčbě po dobu 24 měsíců. Primárním cílovým ukazatelem byla doba do progrese onemocnění nebo úmrtí, medián sledování dosáhl 22,9 měsíce.

„Na léčbu olaparibem podle očekávání dobře odpověděly pacientky s mutací BRCA, s HRD a s mutací BRCA současně, což také nebylo překvapení – ale výsledek se dostavil i u pacientek s HRD bez mutace BRCA,“ zdůraznil prof. McKee a dodal: „Ve studii bylo pacientek HRD‑pozitivních 48 procent, z toho 19 procent nemělo mutaci BRCA. Připočteme‑li k tomu dalších 18 procent s nejasným stavem HRD, znamená to, že pokud se budou rutinně testovat pouze mutace BRCA, přibližně 40 procent pacientek s ovariálním karcinomem se nedostane k léčbě, ze které mohou mít prokazatelný prospěch.“

Existují dva molekulárněgenetické přístupy a na nich založené testy stanovení HRD pozitivity. Prvním je hledání efektu HRD, tedy pátrání po charakteristických rysech, které jsou v genomu výsledkem defektu dráhy pro homologní rekombinantní opravy – HRD Genomic Scar. Druhým je hledání příčiny HRD, tedy identifikace takových změn v genomu, které mohou zavinit defekt v dráze homologních rekombinantních oprav – HRR Gene Panel – panelové testování HRR genů.

Současným zlatým standardem je již jednou jmenovaný test Myriad MyChoice CDx, se kterým se všechny novější technologie porovnávají. Prof. McKee uvedl, že konkrétně na jeho ženevském pracovišti se aktuálně testuje SNP čip Oncoscan pro celogenomovou analýzu. Shoda s Myriad MyChoice CDx v záchytu HRD byla v kohortě 569 srovnávacích vzorků z mezinárodního genomického atlasu nádorů (The Cancer Genomic Atlas, TGA) 92 procent. Nyní probíhá další fáze – ověření principu na vlastních vzorcích 47 duktálních karcinomů prsu, 51 ovariálních karcinomů a 16 karcinomů prostaty.

Byla založena i ENGOT HRD European Initiative (Eric Pujade‑Lauraine et al.), jejímž cílem je na vzorcích tkáně získaných ve studii PAOLA‑1 evaluovat, který typ testování HRD‑pozitivity bude pro rutinní využití v klinické praxi u pacientek s pokročilým ovariálním karcinomem ten nejspolehlivější a také nejsnáze proveditelný.

Zdroj: MT