Molekulární diagnostika u karcinomu plic pod drobnohledem

V rámci nedávných Pražských onkologických dní proběhlo sympozium s názvem „Co všechno jste chtěli vědět o molekulární diagnostice karcinomu plic a báli jste se zeptat…“, podpořené společností Boehringer Ingelheim. Jediným přednášejícím zde byl přednosta Fingerlandova ústavu patologie LF UK a FN Hradec Králové prof. MUDr. Aleš Ryška, Ph.D. Měl tak prostor věnovat se této problematice podrobněji, než je běžné.

Nemalobuněčný karcinom plic (NSCLC) představoval po desetiletí téměř homogenní klinickou jednotku se špatnou prognózou a velmi limitovanými terapeutických možnostmi. V poslední dekádě se ale začal rozpadat na celou řadu podskupin podle jednotlivých genových aberací. Těch velmi pravděpodobně budou v blízké budoucnosti desítky, v široké klinické praxi mají zatím význam zejména dvě z nich. První představují změny v genu anaplastické lymfomové kinázy (ALK). Druhým klinicky relevantním cílem jsou mutace pro receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR). Jak optimalizovat záchyt nemocných, jejichž nádor nese tyto znaky, bylo tématem sdělení, které na Pražských onkologických dnech prof. MUDr. Aleš Ryška, Ph.D., přednesl.

„Bez molekulární diagnostiky se dnes neobejdeme, zlatým standardem diagnostiky je však stále morfologie,“ vymezil prof. Ryška základní hranici hned v úvodu své prezentace.

Karcinom plic představuje onemocnění, které je (nejen) v České republice ve velké většině případů diagnostikováno v pozdních stadiích. „Zpravidla proto do našich laboratoří nedostáváme resekát odebraný při operaci, ale pracujeme s cytologickými nátěry, malými vzorky z transbronchiální nebo transthorakální biopsie, cytospinovými preparáty nebo cytobloky z výpotku.“ To s sebou přináší jeden zásadní limit komplexní diagnostiky nádorů plic – s tkání se musí šetřit, protože je jí málo.

U dobře diferencovaného nádoru není pro patologa problém určit, zda jde o adenokarcinom, nebo o dlaždicobuněčný karcinom. Situaci však komplikuje fakt, že nezanedbatelnou část nálezů představují nediferencované nádory bez jakýchkoli charakteristických morfologických rysů. „Pak ke správnému zařazení potřebujeme imunohistochemii, abychom mohli říci, že jde například o nemalobuněčný karcinom spíše adenokarcinom anebo o nemalobuněčný karcinom spíše dlaždicobuněčný. I to nám pomůže, abychom vybrali nádory vhodné pro molekulární diagnostiku. Standardně hledáme mutace aktivační a v poslední době nás zajímají i mutace rezistentní. Nemá smysl složitě a nákladně vyšetřovat tam, kde je pravděpodobnost záchytu mutace mizivá, a my víme, že u skvamózního karcinomu mutace ovlivnitelné současnou terapií v podstatě nejsou.“ I u adenokarcinomu ale záleží na konkrétní populaci – geografická variabilita je značná především u mutace EGFR. Zatímco v Evropě se její prevalence u adenokarcinomu pohybuje mezi pěti až patnácti procenty, ve východní Asii to může být až u poloviny nemocných. Prof. Ryška zmínil v této souvislosti český registr KELLY, kam se v řadě laboratoří patologie zadávají data pro všechny nově diagnostikované karcinomy plic. Ze 770 vzorků vyšetřených na EGFR zde byla tato mutace prokázána u 12 procent, což odpovídá kontextu ostatních evropských zemí.

Kdy tedy testování EGFR smysl nemá? V první řadě u nádorů s minimální či nulovou pravděpodobností mutace – tedy především u skvamózního karcinomu, malobuněčného karcinomu či sarkomatoidního karcinomu; takové určení je v rukou patologa. Dále jde o vzorky, které jsou nevhodné – například u nich převažuje zánětlivé pozadí a výsledek by mohl být falešně negativní. I to určí patolog. Jiná rozhodnutí jsou ale na klinikovi. „Nemá význam testovat, pokud nezvažujeme příslušný terapeutický zásah. To se týká hlavně nádorů v časném stadiu. Patolog přitom nepozná, že jde o nemocného s operabilním, potenciálně kurabilním nálezem. Potřebuje tedy tuto informaci od klinika, respektive od multidisciplinárního týmu. Pak jsou zde nemocní na druhém konci spektra, kde již tyrosinkinázové inhibitory nepřipadají v úvahu z jiných klinických důvodů. I tuto informaci patolog musí dostat zvenčí,“ vysvětlil prof. Ryška.

A jakým výzvám testování EGFR v praxi čelí? Jedním z limitů je čas, vyšetření nesmí trvat příliš dlouho. „Podle registru KELLY samotné vyšetření na mutaci EGFR trvá v průměru šest dní, medián je pět dní, což je velmi slušné i v mezinárodním kontextu. Doba mezi příjmem žádanky vyšetření morfologie a uvolněním výsledku EGFR (morfologie + EGFR) je přibližně patnáct pracovních dní. Ve třech čtvrtinách případů se vejdeme do deseti dnů.“

V této souvislosti prof. Ryška zdůraznil význam externího hodnocení kvality. Jak ukazuje analýza výsledků z evropského programu externího hodnocení kvality testování karcinomu plic, podíl selhání dramaticky klesá spolu s tím, jak dlouho se již laboratoř takového programu účastní.

Je třeba počítat i s tím, že mutační status nádoru se mění v souvislosti s proběhlou léčbou. Cílená terapie zablokuje proliferaci dominantní populace, vytváří tak selekční tlak a v jeho důsledku začne přerůstat klon, který je na léčbu rezistentní. Po několika cyklech léčby může mít nádor zcela jiné molekulárněgenetické i morfologické charakteristiky. Podobná heterogenita pak u generalizovaného onemocnění může být mezi různými nádorovými ložisky v různých lokalitách.

Tento limit by mohla překonat tzv. tekutá biopsie z krve. Ta vychází z předpokladu, že jednotlivé klony uvolňují svou DNA do oběhu a tuto DNA je možné z krve izolovat.

Takový postup má své nesporné výhody. „Vzorek lze snadno kdykoli získat bez složité intervence. Tekutá biopsie již prokázala vysokou specificitu – pokud vyšetření ukáže na mutaci, můžeme si být téměř jisti, že tam mutace je.“

Jsou zde ale i významné nevýhody a na ně by se v žádném případě nemělo zapomínat. „Cirkulující nebuněčná nádorová DNA není přítomna u všech pacientů. Navíc nejsme schopni rozlišit, zda volná molekula DNA, která koluje v krvi, skutečně pochází z nádorové buňky. Kvůli tomu tato metoda zatím vykazuje nízkou senzitivitu.“

Množství cirkulující DNA se zvětšuje spolu s objemem nádorové masy. Jsou ale případy generalizovaného karcinomu s minimální hodnotou cirkulující DNA a naopak – časné karcinomy mohou mít této DNA velké množství.

„Podle metaanalýz je celková specificita tekuté biopsie pro stanovení mutace EGFR přes 90 procent, její senzitivita je ale jen kolem 70 procent. Znamená to, že kdybychom spoléhali jen na tento přístup, mineme jednoho ze tří pacientů s mutací.“

Prostor pro tekutou biopsii podle prof. Ryšky vzniká tam, kde je patolog schopen stanovit diagnózu morfologickou, ale vzhledem k nedostatku kvalitní DNA ze vzorku již nikoli diagnózu molekulárněgenetickou. „Tekutá biopsie by v nejbližší době také měla být vhodnou metodou pro stanovení, zda je pacient nosičem rezistentní mutace T790M, tedy zda jde o vhodného kandidáta pro léčbu tyrosinkinázovými inhibitory třetí generace. Až tato léčba bude mít úhradu, rutinní testování v této indikaci bude mít smysl.“

Dále prof. Ryška hovořil o konsensu odborníků, který vznikl na loňském setkání s názvem Mutation day 2016. Šlo o interdisciplinární setkání zaměřené přímo na problematiku komplexní molekulárněgenetické diagnostiky u karcinomu plic. V tomto konsensu se říká:

• Testování mutačního stavu genu EGFR u NSCLC je prováděno reflexně, tj. u všech nemocných s diagnózou adenokarcinomu, NSCLC spíše adenokarcinomu, adenoskvamózního karcinomu a NSCLC NOS.

• Testování EGFR u skvamózního karcinomu je prováděno na vyžádání klinika. („Může jít například o mladé pacienty nekuřáky, kde je poměrně vysoká pravděpodobnost, že jde o smíšený karcinom a patolog vyšetřením zatím postihl pouze jeho skvamózní komponentu,“ komentoval prof. Ryška.)

• Laboratoř je povinna účastnit se etablovaného programu externího hodnocení kvality, pokud je dostupný.

• Metoda, kterou je testováno, musí detekovat aktivační i rezistentní mutace (např. EGFR T790M). Vlastní výsledek je vždy doplněn komentářem o charakteru a významu detekovaných mutací.

Prof. Ryška zdůraznil, že zásadní je komplexní součinnost patologa, molekulárního biologa a klinika. K tomu patří i podrobný popis ze strany laboratoře, co výsledek znamená. Je nutná také komunikace o optimalizaci preanalytické fáze. Ta se podle registru KELLY daří – vzorků vyřazených z testování EGFR pro nepoužitelnost v čase ubývá, dnes jich je kolem pěti procent.

Dalším dnes již rutinním vyšetřením je testování na přítomnost aberantního fúzního genu EML4‑ALK (ALK). To je podstatně složitější než u mutace EGFR. „Ke zlomu zde dochází v různých oblastech genu a jsou zde různí fúzní partneři, nejen EML4. Není možné používat standardní diagnostiku PCR, ale zpravidla se využívá fluorescenční in situ hybridizace (FISH).“

Tím se samozřejmě dostává do popředí i otázka nákladů. Čím nižší je incidence markeru, tím vyšší jsou náklady na identifikaci pozitivních nemocných. Pro vzácné markery, jak je ALK nebo ROS‑1, je to zásadní. V České populaci jsou na ALK pozitivní 3,2 procenta vzorků, přestavba ROS‑1 se vyskytuje ještě vzácněji.

Řešením je snížení ceny testu nebo testování více markerů najednou. Přestavbu ALK lze kromě FISH detekovat i imunohistochemicky – a tedy levněji. Imunohistochemie se používala jako jakási screeningová metoda, kde v případě pozitivity nemocní dále postupovali na vyšetření FISH. Mezi těmito přístupy není plná konkordance. Ukázalo se, že i nemocní s pozitivitou jen v jednom z těchto testů z léčby inhibitory ALK profitují. Případy diskordance ale nejsou příliš časté; pokud je jich příliš, budí to pozornost týkající se kvality práce laboratoře.

Podle nového diagnostického algoritmu je tak imunohistochemie metodou první volby. Pokud je pacient jasně pozitivní, je kandidátem léčby inhibitorem ALK. Ti, kteří jsou jasně negativní, kandidáty nejsou. Pouze sporně pozitivní se následně ověřují FISH. „Stále považujeme za platné dogma, že mutace EGFR a ALK se navzájem vylučují. Nemá tedy význam EGFR pozitivní nemocné dále testovat na ALK. Pro úsporu času se ale vyplatí dělat tyto testy zároveň a v praxi k tomu také dochází.“

Je potřeba si uvědomit, že ani optimální využití molekulárněgenetických metod pro většinu nemocných zatím nevede k cílené léčbě – cca 80 až 85 procent adenokarcinomů a prakticky všechny skvamózní karcinomy jsou bez terapeuticky ovlivnitelné mutace.

Zřetelný další posun však nabízí imunoterapie, konkrétně pak odbrzdění protinádorového imunitního procesu blokádou signální dráhy mezi proteinem PD‑1 na lymfocytu a jeho ligandem PD‑L1 na nádorové buňce. Pro detekci pacientů, kteří z této léčby mohou nejvíce profitovat, se imunohistochemicky vyšetřuje právě exprese PD‑L1. „Z mnoha důvodů má ale toto hodnocení k ideálnímu markeru daleko, jde o metodicky a interpretačně náročné vyšetření, jeho hodnota je pouze pravděpodobnostní.“ I pro ně je zapotřebí vzorek tkáně – a té je téměř vždy málo.

Prof. Ryška popsal, jak na jeho pracovišti tomuto problému čelí. „Na imunohistochemické stanovení ALK pozitivity potřebujeme histologické vzorky či cytobloky, cytologické nátěry nejsou vhodné. Pokud máme tkáň, šetříme si ji právě na vyšetření ALK či případně na vyšetření PD‑L1, mutaci EGFR vyšetřujeme z cytologie, pokud nám ji klinik zašle. Zároveň s přípravou barveného materiálu na morfologickou diagnostiku připravujeme několik nebarvených imunohistochemických preparátů. Pokud morfologie není jasná, k zařazení nádoru doplňujeme imunohistochemii. Pokud je morfologická diagnóza jasná, rovnou začínáme s vyšetřením ALK, v případě požadavku ze strany klinika lze vyšetřit také ROS‑1. Z dalších preparátů je možné provést vyšetření na mutaci EGFR. Když si klinik zažádá, ještě máme rezervní tkáň pro vyšetření PD‑L1 pro eventuální indikaci imunoterapie.“

Díky komplexnímu patologickému vyšetření tak lze dnes nemocné rozdělit do tří skupin. První tvoří ti, jejichž nádor vykazuje mutaci ovlivnitelnou cílenou léčbou. Do druhé skupiny spadají nemocní s vysokou expresí PD‑L1, kteří mohou být kandidáty imunoterapie. U zbytku nemocných pak je stále namístě systémová chemoterapie.

V závěru svého sdělení se prof. Ryška pokusil shrnout to nejpodstatnější do několika bodů:

• Něco jako nemalobuněčný karcinom plic neexistuje, jedná se o heterogenní skupinu nádorů s odlišnou etiopatogenezí i prognózou.

• Morfologická typizace zůstává alfou a omegou, i proto, že nám pomáhá identifikovat nemocné, u nichž budeme dále provádět molekulární diagnostiku.

• Detekce EGFR a ALK je u správně vybraných nádorů rutinní záležitostí, detekce ROS‑1 je blízká budoucnost, až se podaří získat úhradu pro léčbu.

• Cílená léčba je využitelná u omezeného počtu pacientů.

• Velké změny lze očekávat s nástupem imunoterapie, ani ta ale nebude pro většinu nemocných.

• Detekce PD‑L1 je rutinně zvládnutelná, tento marker má daleko do ideálu.

Nakonec prof. Ryška odkázal na webové stránky společnosti českých patologů (www.patologie.info), kde je i seznam referenčních laboratoří spolu s výčtem markerů, které vyšetřují.

V následné diskusi zazněla mimo jiné otázka, zda jsou laboratoře připravené na větší nápor žádostí o tato vyšetření, který se dá očekávat. „Kapacitně by to neměl být problém, za touto diagnostikou ale musejí jít peníze. Zatím je dominantně hrazena z budgetu nemocnice,“ odpověděl prof. Ryška.

K VĚCI...

Aktualizovaný seznam referenčních laboratoří a vyšetřovaných markerů k 1. 1. 2017

• Bioptická laboratoř, Plzeň (HER2, RAS, EGFR, ALK, BRAF)

• Fingerlandův ústav patologie, Hradec Králové (HER2, RAS, EGFR, ALK, BRAF)

• Referenční laboratoř LF UP, Olomouc (HER2, RAS, EGFR, ALK, BRAF)

• Patologicko-anatomické odd., MOÚ Brno (HER2, RAS, EGFR, ALK, BRAF)

• Ústav patol. a molek. medicíny, 2. LF UK a FN Motol, Praha (HER2, RAS, EGFR, ALK, BRAF)

• Ústav patologie, 1. LF UK a VFN, Praha (HER2, RAS, EGFR, ALK, BRAF)

• Odd. patologie, Thomayerova nemocnice, Praha (RAS, EGFR, ALK, BRAF)

• Aeskulab, Praha (HER2)

• Ústav patologie, FN Brno (HER2, RAS, EGFR, ALK, BRAF)

• Laboratoře Agel, Nový Jičín (RAS, EGFR, ALK, BRAF)

• CGB Ostrava (HER2, RAS, ALK, EGFR, BRAF)

Zdroj: MT