Molekulárně genetická diagnostika X‑vázané formy Alportova syndromu

Alportův syndrom (AS) je geneticky heterogenní dědičné onemocnění ledvin, v 80–85 % případů je způsobeno mutacemi genu COL4A5 na chromosomu X (XLAS). Mutace v genech COL4A3 a COL4A4 na 2. chromosomu jsou zodpovědny za zbylé případy AS syndromu přenášeného autosomálně recesivně nebo autosomálně dominantně.

Molekulárně genetické metody mají v diagnostice XLAS stále větší význam. U pacientů s pozitivní rodinnou anamnézou se provádí nejdříve vazebná analýza. V této práci byly stanoveny nové mikrosatelitní markery, u nichž je minimální možnost rekombinace (1,2 %), a proto se mohou využít i v prenatální diagnostice.

Tuto metodu nepřímé diagnostiky XLAS však není možné uplatnit u malých rodin a u sporadických případů onemocnění. Pacienti s negativní rodinnou anamnézou tvoří 12 % pacientů s mutacemi genu COL4A5. Přímá detekce mutací z DNA z periferní krve je velmi drahá a náročná metoda, protože jde o velmi rozsáhlý gen (51 exonů). Senzitivita detekční metod je 30–70 %. Je popsáno asi 300 různých mutací v genu COL4A5.

Mutační analýza v této práci byla prováděna z mRNA. Gen COL4A5 je exprimován v ledvinách, oku, uchu, kůži, ale není exprimován v periferních lymfocytech. Již dříve byla zkoušena mutační analýza RNA z fibroblastů kůže. Tato metoda je ale laboratorně velmi náročná, kultivace fibroblastů trvá tři až čtyři týdny.

Proto byla zavedena metoda izolace mRNA z vlasových kořínků, následovaná reverzní transkripcí do cDNA a poté přímá sekvenace pouze deseti překrývajících se úseků cDNA. Záchytnost touto levnější a relativně rychlejší detekční metodou byla 77 % u mužů a 71 % u žen. Touto technikou není možné zachytit rozsáhlé delece genu u heterozygotních žen (sekvenuje se pouze normální X chromosom).

Některé transkripty nesoucí nonsense mutaci podléhají specifické degradaci, proto jejich záchyt z RNA může být snížen. Na druhou stranu je to velmi výhodná metoda na záchyt významných střihových mutací (mutací, které se projeví na úrovni RNA).

V této studii byly nalezeny střihové mutace ve 41 % případů, zatímco v databázi mutací COL4A5 (Human Gene Mutation Databáze) pouze v 17 % případů. Mutační analýzou DNA by polovina střihových mutací v tomto souboru nebyla zastižena.

Tato práce navrhuje jednoduchou (10 překrývajích se fragmentů), rychlou (výsledky do týdne) a výkonnou (více než 70% záchytnost mutací) metodu detekce mutací u pacientů s XLAS. Tato metoda je použitelná i u malých rodokmenů a sporadických případů.

Komentář

Autor: MUDr. Jana Reiterová, Ph.D.

Alportův syndrom je systémové onemocnění, které se projevuje postižením ledvin (mikroskopickou hematurií v dětství, občas s epizodami makroskopické hematurie), rozvojem proteinurie (často až nefrotickým syndromem v druhém decenniu) a následně postupnou progresí renální insuficience.

Typickým nálezem ve vzorku z renální biopsie je ztenčení a následně rozvláknění glomerulárních bazálních membrán zjistitelné až vyšetřením v elektronovém mikroskopu. Prevalence onemocnění je 1 : 5 000 a pacienti s AS tvoří 1–2 % pacientů v dialyzačním programu. Až u 80 % pacientů s AS je přítomna oboustranná porucha sluchu (často hluchota).

U 40 % pacientů jsou udávány oční abnormity (specifická makulopatie a přední lenticonus vedoucí k recidivujícím erozím rohovky). Diagnóza XLAS je založena na pozitivní rodinné anamnéze.

U 10–15 % dětí s XLAS vznikají však mutace de novo (Jais et al., 2000). U pacientů s glomerulární erytrocyturií by měli být vyšetřeni vždy ohledně hematurie oba rodiče a sourozenci. Avšak asi 5 % přenašeček XLAS nemá hematurii (Jais et al., 2003). Pacienti s hematurií, suspektní rodinnou anamnézou (stran hematurie a event. renálního selhání) nebo pacienti současně s oboustrannou poruchou sluchu by měli podstoupit kožní a event. renální biopsii. Ale ani normální imunohistochemický nález z renální a kožní biopsie nemůže jednoznačně diagnózu AS vyloučit. Molekulárně genetická analýza AS není v České republice dostupná.

O tuto diagnostiku projevují zájem především přenašečky formy XLAS. U těchto žen nebývá průběh onemocnění tak benigní, jak se dříve myslelo. Až třetina žen s XLAS po 60. roce věku dospěje do stadia selhání ledvin.

K renální insuficienci dojde asi u 28 % pacientek mezi 19–30 roky, u 31 % mezi 31–40 roky a po 41. roce u 41 % (Jais et al., 2003). Tíže průběhu onemocnění u heterozygotních pacientek závisí na procentu inaktivace postiženého chromosomu X (Wang et al., 2006) a na typu mutace v genu COL4A5. Podobně jako u mužů jsou rozsáhlé genové přestavby (především velké delece) a nonsense mutace vedoucí ke krátkému proteinu spojeny s těžším průběhem onemocnění. Byla zjištěna až 90% pravděpodobnost renálního selhání do 30 let věku u postižených mužů s rozsáhlými delecemi a nonsense mutacemi v genu COL4A5. Naopak u pacientů s missense mutacemi nebo střihovými mutacemi je tato pravděpodobnost pouze 50% (Jais et al., 2000). Byla popsána i missense mutace v nekolagenní doméně, kdy docházelo k renálnímu selhání u mužů až po 60. roku věku a nebyla přítomna porucha sluchu v rodině (Wilson et al., 2007).

Přenašečky XLAS mají vzhledem k závažnému klinickému průběhu tohoto onemocnění velmi často zájem o prenatální, event. preimplantační diagnostiku XLAS u mužských potomků. Zjištění určité mutace v rodině umožní těmto ženám nejen volbu pohlaví plodu (mnohé volí raději přerušení těhotenství v případě zjištění mužského pohlaví plodu), ale i možnost zjištění, zda mužské embryo při preimplantační diagnostice nebo plod mužského pohlaví při prenatální diagnostice je či není nositelem mutace v genu COL4A5.

Plnou verzi článku najdete v: Postgraduální nefrologie 6/2007, strana 85

Zdroj: