Minimální reziduální choroba u karcinomu pankreatu

Poměr karcinomem pankreatu postižených mužů a žen je přitom 1,3 : 1 a nejčastější výskyt je udáván někde mezi 65 až 80 lety věku. Medián přežití od stanovení diagnózy je bez chirurgické léčby 3 až 11 měsíců, po chirurgické léčbě v různých studiích pak mezi 13 až 20 měsíci, celkové pětileté přežití je pod dvě procenta. Etiologické faktory, které by nás mohly nasměrovat k prevenci a časné detekci, jsou velmi nespecifické, jde o kouření, stravu bohatou na tuky, maso, energii, karcinogeny v potravě, a tudíž jejich využití je minimální. Zhruba 70 až 80 % karcinomů je lokalizovaných v hlavě pankreatu a v processus uncinatus, 20 % v těle pankreatu a 10 % v kaudě pankreatu, histopatologicky v drtivé většině jde o duktální adenokarcinomy v různém stupni diferenciace, ostatní karcinomy jsou poměrně vzácné.

Léčba karcinomu pankreatu je multimodální, jedinou potenciálně kurativní metodou je stále a jen chirurgická R0 resekce. Radikální chirurgický výkon je možný jen u zlomku pacientů s tímto typem malignity (cca 20 %). Nejčastější kontraindikací výkonu je prokázaná generalizace (M1, zjištěná zhruba u 40 % nemocných v době stanovení diagnózy) či lokálně pokročilý nález (T4, který je přítomen cca u 40 % nemocných). Přežití nemocných po radikální operaci je i přes rozšíření chirurgické radikality ve srovnání s léčbou jiných malignit stále velmi nepříznivé.

Jako významné nepříznivé prognostické faktory pro délku přežití po resekci jsou udávány zejména pozitivita nádoru v uzlinách, grading nádoru, velikost tumoru větší než 2,5 cm, přítomnost nádoru v resekční linii, cévní invaze, invaze nádoru přes kapsulu, což podmiňuje časnou lokální recidivu. Vzdálené metastázy a karcinomatóza peritonea jsou způsobeny časnou diseminací nádorových buněk, a to buď cestou hematogenní, či lymfogenní.

Minimální reziduální choroba

Jako minimální reziduální chorobu tak označujeme přítomnost cirkulujících nádorových buněk v krvi, kostní dřeni, lymfatických uzlinách a dutině peritoneální, potažmo také v jiných tělesných prostorech, a tyto buňky jsou pak prekursory rozvoje vzdálených metastáz primárního nádoru. Přesný mechanismus etiopatogeneze od těchto diseminovaných nádorových buněk až k mase vlastní metastázy však dosud neznáme. Na tyto časně diseminované nádorové buňky se může v budoucnu specificky a individuálně zaměřit jak chemoterapie, tak i nové metody biologické léčby, např. monoklonálními protilátkami, či dokonce metody genové terapie. Pro výběr pacientů, kteří by mohli z této léčby profitovat, je vhodné detekovat tyto diseminované nádorové buňky moderními molekulárně-biologickými metodami a stanovit tzv. minimální reziduální chorobu (minimal residual disease, MRD).

O samotné minimální reziduální chorobě se mluví poměrně dlouhou dobu, zásadní změnu v pohledu na ni přinesly nové metodiky stanovení přítomnosti volných cirkulujících nádorových buněk v těle pacientů na základě exprese markerů jednotlivých nádorových buněk, a to především pomocí metodiky real-time RT-PCR (reversně transkriptázová polymerázová řetězová reakce v reálném čase). Cílem této metody je detekovat hledaný znak nádorových epiteliálních buněk na úrovni RNA sekvence (informační RNA - mRNA). Jde tedy v podstatě o metodu, která při detekci minimální reziduální choroby využívá studia genové exprese. K tomuto účelu se tedy nejdříve pomocí reversní transkriptázy izolovaná RNA přepíše do komplementární DNA (cDNA), která je pak využita jako templát pro PCR reakci.

Nejčastěji používanými cílovými sekvencemi pro detekci minimální reziduální choroby metodou RT-PCR u solidních nádorů jsou cytokeratiny, karcinoembryonální antigen, mamaglobin, mucin aj. Výhodou tohoto postupu je nízká stabilita RNA po uvolnění z buňky a většinou detekce živých buněk. Kvantitativní RT-PCR v reálném čase (real-time QRT-PCR) je metoda umožňující přesnou a absolutní kvantifikaci hledané cDNA sekvence ve vzorku.

Využívá se zde několika možností detekce narůstajícího množství amplikonů během reakce. Všechny jsou založeny na nárůstu fluorescence. Principiálně nejjednodušší je metoda využívající fluorescenčních barviv, která se interkalují mezi báze DNA (např. Sybr Green), narůstající fluorescence pak odpovídá vzrůstajícímu množství amplikonů ve vzorku.

V současnosti je asi nejvíce rozšířená metoda využívající 5-exonukleázové aktivity DNA polymerázy. Klíčovým je zde použití oligonukleotidu - proby (nejčastěji TaqMan sonda), jež se specificky váže na sekvenci mezi oběma primery. Sonda je na jednom konci označena fluorescenční látkou a na druhém konci zhášečem fluorochromu. Při syntéze komplementárních vláken provede DNA polymeráza hydrolytické štěpení TaqMan sondy, čímž dojde k uvolnění fluorescenční látky a nárůstu fluorescence, která je detekována a zaznamenána v reálném čase. Tato metoda umožňuje detekovat jednu nádorovou buňku až mezi deseti miliony nenádorových buněk. Sestrojením standardizačních křivek lze přesně a absolutně kvantifikovat množství hledané cDNA sekvence vybraného markeru ve vzorku.
Pilotní studie FN Olomouc

Do pilotní studie bylo zařazeno 52 pacientů operovaných na I. chirurgické klinice FN v Olomouci pro karcinom pankreatu. Rozsah výkonu se pohyboval od prosté explorace s biopsií přes spojkové operace - CHDA a GEA - až po radikální výkon u tumorů hlavy pankreatu v podobě pravostranné duodenopankreatektomie. Zlatým standardem na našem pracovišti se stala pylorus šetřící duodenopankreatektomie (PPDP), zavedená v roce 1944 Watsonem, v moderní modifikaci Traversa a Longmireho z roku 1978, zahrnující výslednou rekonstrukci na první kličku jejuna v tomto Pořadí - 1. terminolaterální pankreatojejunoanastomóza, 2. terminolaterální hepatikojejunoanastomóza a 3. antekolická terminolaterální gastroenteroanastomóza. Naše pracoviště dosahuje mortality pod 5 % a pod 10 % klesá rovněž počet pooperačních dehiscencí v oblasti pankreato-jejunálních a hepatiko-jejunálních.

Vlastní stanovení minimální reziduální choroby probíhá ve spolupráci s Laboratoří experimentální medicíny při Dětské klinice FN v Olomouci. Jako sledované markery pro karcinom pankreatu byly stanoveny telomeráza (hTERT), receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR1) a karcinoembryonální antigen (CEA), vyšetřované v kostní dřeni, periferní a systémové krvi, peritoneální laváži a také odběr vzorku nádoru pro případnou genovou analýzu, které ukládáme do RNA lateru. Byla stanovena také kontrolní hodnota exprese hTERT ve vzorcích 52 dobrovolných dárců krve. Metodický postup zahrnuje: * Izolaci RNA po lýze erytrocytů/centrifugaci peritonální laváže fenol-chloroformovou metodou dle Chomczynského (trizol) z 11 milionů jaderných buněk krve, kostní dřeně či peritoneální laváže. Solidní tkáně nádoru jsou před izolací RNA homogenizovány za pomocí homogenizéru RETSCH MM 301.

Koncentrace a čistota vyizolované mRNA je stanovena UV spektrofotometricky.

* Transkripce 3 ug RNA/30 ul reakční směsi za použití random primerů, H-minus M-MuLV reversní transkriptázy (Fermentas).

* QRT-PCR reakce - reakční směs 25 ul, směs obsahuje specifické primery, TaqMan sonda jako fluorescenční činidlo, 100 ng testované cDNA a další chemikálie běžné pro PCR reakce.

* Sekvence primerů a proby: hTERTs 5'-atgtcacggagagaccacgttt-3', hTERTas 5'-gcaccctcttcaagtgctg-3', hTERTprobe 5'-tggagcaagttgcaaagcattgga-BHQ_ HEX-3'.

* Absolutní kvantifikace na základě standardizační křivky (standardy - plazmová DNA).

Výsledky pilotní studie

Námi zjištěné hodnoty testovaných pacientů byly korelovány s klinicko-patologickými charakteristikami a s parametry přežití. Prokázali jsme statisticky významnou souvislost mezi mírou exprese EGFR v portální krvi a klinickým stadiem, kde pacienti s pokročilým onemocněním mají vyšší expresi EGFR v portálním řečišti než pacienti s nízkým klinickým stadiem. Obdobně koreluje vztah exprese EGFR v portální krvi vzhledem ke gradingu, kdy mnohem vyšší expresi EGFR nacházíme u pokročilých stadií onemocnění než u nízkých.

Dále jsme prokázali vysokou expresi EGFR v peritoneální laváži pacientů s metastatickým postižením, na rozdíl od pacientů bez metastáz. Signifikantní závislost nebyla stanovena mezi ostatními testovanými markery (hTERT, CEA) a ostatními kompartmenty (systémová krev, kostní dřeň). Dalším zjištěním bylo hodnocení vztahu délky přežití vzhledem k pozitivitě exprese testovaných markerů v peritoneální laváži. Byl prokázán signifikatnní pokles přežívání u pacientů s pozitivní expresí EGFR a CEA v předoperační peritoneální laváži. A dále jsme prokázali, že také pozitivita hTERT v systémové a portální krvi predikuje výrazně nižší dobu přežívání.

Diskuse

Cílem naší pilotní studie bylo tedy najít vhodné nádorové markery k detekci minimální reziduální choroby u karcinomu pankreatu. Jednou z mnoha vlastností solidních nádorů je totiž jejich heterogenita a genetická nestabilita. Také cirkulující nádorové buňky jsou z genetického pohledu heterogenní skupinou.

Nalezení vhodného, dostatečně senzitivního i specifického markeru cirkulujících nádorových buněk je tedy velmi obtížné. Vycházeli jsme ze znalostí exprese genů u nádorových buněk kolorektálního karcinomu a výsledků recentních studií, které se již zabývaly stanovením pozitivity MRD u karcinomu pankreatu na základě exprese CK19, CK20 a mutantního K-ras. A jako možné markery nádorových pankreatických buněk byla vybrána telomeráza, karcinoembryonální antigen a epidermální růstový faktor.

Kvantitativní stanovení genové exprese markerů MRD umožňuje určit cut-off hodnoty s rozlišením mezi fyziologickým a patologickým stavem. Následně umožňuje posoudit změny v přítomnosti cirkulujících nádorových buněk během dispenzarizace pacienta. Cut-off hodnoty byly určeny v naší studii na základě analýzy exprese výše uvedených markerů v kontrolní skupině zdravých dárců krve.

Peroperačně (ale před vlastní manipulací a odstraněním tumoru pankreatu) byly odebírány vzorky kostní dřeně, systémové a portální krve a peritoneální laváže, které byly podrobeny stanovení přítomnosti nádorových buněk na základě exprese CEA, EGFR1 a hTERT pomocí real-time RT-PCR metodiky. Tyto výsledky byly korelovány s klinicko-patologickými veličinami (velikost tumoru, radikalita výkonu, pozitivita lymfatických uzlin, klinické stadium a grading stupně diferenciace tumoru) a celkovým přežíváním.

Výsledně pak byla prokázána statisticky významná souvislost mezi:

* expresí EGFR1 v portální krvi a klinickým stadiem (p = 0,006), kde pacienti s pokročilým stadiem mají vyšší expresi EGFR1 v portálním řečišti než pacienti s nízkým klinickým stadiem;

* expresí EGFR1 v portální krvi se stupněm diferenciace primárního tumoru, kde pacienti s tumory G3 mají statisticky významně vyšší expresi EGFR1 (p = 0,045).

Dále byla prokázána vysoká exprese EGFR1 v peritoneální laváži pacientů s metastatickým postižením, na rozdíl od pacientů bez přítomnosti metastáz (p = 0,015). Bohužel se nepodařilo prokázat signifikantní závislost mezi ostatními testovanými markery (hTERT, CEA) a ostatními kompartmenty (systémová krev, kostní dřeň).
Při hodnocení vztahu exprese markerů a přežívání bylo sledováno několik zajímavých výsledků. A to především při hodnocení přežití vzhledem k pozitivitě exprese testovaných markerů v peritoneální laváži.
Exprese EGFR1 (p = 0,01) a CEA (p = 0,1) v peritoneální laváži značí kratší celkové přežívání pacientů s karcinomem pankreatu. Dále bylo prokázáno statisticky významně kratší přežívání u pacientů s pozitivitou hTERT v systémové a portální krvi (p < 0,06, p < 0,015).

Výsledky naší pilotní studie tedy potvrzují dostatečnou specificitu a v případě námi vybraných nádorových markerů i dostatečnou senzitivitu real-time RT-PCR metodiky pro detekci minimální reziduální choroby u pacientů s karcinomem pankreatu. Byly vybrány vhodné markery detekce pankreatických nádorových buněk a ve spolupráci s L aboratoří experimentální medicíny zdokonalena vlastní metodika odběru materiálu a jeho následné zpracování. Pouze necelých 40 % operovaných testovaných pacientů bylo klinického stadia I až III a byl u nich proveden radikální chirurgický výkon. Tento fakt bohužel značně snižuje použití metodiky pro prognostické účely.

Výsledek je také ovlivněn velmi nízkým přežíváním pacientů po radikálních výkonech pro karcinom pankreatu; na rozdíl od karcinomu kolorekta či prsu, které představují potenciálně kurabilní onemocnění a u nichž lze sledovat "disease-free survival" v mnohem delším časovém úseku, a tedy také potenciál predikce je mnohem vyšší u těchto typů karcinomu než u karcinomu pankreatu. Přesto však byli v této skupině identifikováni pacienti s kratším přežíváním, a to na základě exprese vybraných markerů - hTERT, CEA a EGFR1 v krvi a peritoneální laváži.

Dalším cílem naší studie je sledování dynamiky minimální reziduální choroby v čase a sledování DFI u pacientů po radikálních výkonech. Výsledky zatím nejsou k dispozici. Otázkou k zamyšlení také zůstává možnost použití techniky real-time RT-PCR k odlišení - často někdy velmi obtížnému - diferenciální diagnostiky mezi karcinomem pankreatu a chronickou pankreatitidou, která představuje jistý predilekční prostor k rozvoji karcinogeneze. Vlastní a potenciální význam stanovení minimální reziduální choroby u karcinomu pankreatu pro klinickou praxi vidíme především ve zpřesnění stagingu onemocnění, mluvíme o tzv. ultrastagingu, který jistě již brzy rozšíří klasickou TNM klasifikaci. Dále je možné zhodnotit přežívání a přežití bez známek onemocnění u pacienta s karcinomem pankreatu v závislosti na daném ultrastadiu. Je možné vyselektovat rizikovou skupinu ohroženou časnou recidivou onemocnění, a to na základě MRD pozitivního statutu.

Minimální reziduální choroba u karcinomu pankreatu může také v budoucnu ovlivnit indikaci a průběh další adjuvantní onkologické léčby. Lze také předpokládat, že pozitivita minimální reziduální choroby u hraničně operabilních stadií karcinomu pankreatu může vyselektovat pacienty, u nichž právě na základě této znalosti pozitivity je možné prohlásit toto onemocnění za systémové. Obzvláště za situace, kdy v daném ultrastadiu onemocnění by bylo vhodné kontraindikovat extenzivní a řadou rizik zatížený operační výkon, který představuje větší riziko letality a morbidity, než by byl možný benefit z tak radikální léčby.

Závěr

V naší studii byla ověřena možnost detekce minimální reziduální choroby u karcinomu pankreatu pomocí sledování nádorových buněk na základě exprese stanovených markerů, tj. karcinoembryonálního antigenu, telomerázy a receptoru pro epiteliální růstový faktor, pomocí metody real-time RT-PCR, a to s dostatečnou senzitivitou a specificitou. Byla stanovena metodika diagnostiky nádorových pankreatických buněk pomocí vlastního designu prob použitých v laboratorních podmínkách.

Podařilo se také standardizovat metodiku odběrů systémové a portální krve, peritoneální laváže a kostní dřeně, které byly podrobeny další diagnostice. V našem souboru pacientů byly korelovány získané výsledky stran pozitivity či negativity minimální reziduální choroby s jednotlivými patologicko-anatomickými činiteli a s délkou přežívání. Přitom byla prokázána statisticky signifikatní závislost mezi detekcí exprese EGFR1 v portální krvi a klinickým stadiem, expresí EGFR1 v portální krvi vzhledem ke stupni diferenciace tumoru a také vztah exprese EGFR1 v peritoneální laváži a k přítomnosti vzdálených metastáz.

Při porovnání exprese stanovených markerů s délkou přežívání bylo zjištěno, že vysoce pozitivní exprese EGFR1 a CEA v peritoneální laváži a pozitivita exprese hTERT v systémové a portální krvi značí kratší přežívání nemocných. Byla tedy ověřena možnost využití detekce minimální reziduální choroby jako nezávislého prognostického faktoru u karcinomu pankreatu.

Bohužel však dosud není zcela vyjasněn klinický impakt stanovení minimální reziduální choroby, neboť řada výsledků je rozporuplná. Jednoznačný klinický benefit minimální reziduální choroby u karcinomu pankreatu je tedy nutné dále ověřit v různých podmínkách, s různým designem detekce nádorových pankreatických buněk, a to na velké skupině pacientů.

Projekt byl podpořen grantem IGA MZ ČR č. 9937-4.

Zdroj: Medical Tribune