Jaká je optimální metoda testování mutace ALK u plicního karcinomu?

FISH vs. imunohistochemie s podporou sekvenování nové generace

Časopis The Oncologist (2015;20:1–7) uveřejnil článek Fluorescenční in situ hybridizace, imunohistochemie a sekvenování nové generace v detekci fúze/translokace EML4‑ALK u plicního karcinomu. Jde o práci kolektivu autorů* o využití imunohistochemického testování fúze/translokace genu EML4‑ALK u plicního karcinomu, protože doposud doporučované vyšetření fluorescenční in situ hybridizace vykazuje u části případů falešně negativní výsledky. Tím jsou tito pacienti ochuzeni o možnost cílené terapie zaměřené na mutovaný gen ALK. Ve sporných případech je vhodné použít diagnostiku sekvenováním nové generace.

FDA schválila jako doporučenou metodu testování fúze/translokace EML4‑ALK u plicního karcinomu fluorescenční in situ hybridizaci (FISH). Dostupná data však svědčí o tom, že imunohistochemické testování (IHC) má pro tyto účely více důkazů úspěšnosti. Přestože je FISH považována za zlatý standard, neexistují komparativní data s výsledky sekvenování nové generace (NGS). Autoři předkládají retrospektivní analýzu, porovnávající výsledky testování u 51 pacientů s pokročilým plicním adenokarcinomem, která má podporu i v literárních údajích. Ve sledovaném souboru byly metodou FISH potvrzeny čtyři pozitivní nálezy fúze/translokace EML4‑ALK (7,8 %), ale IHC prokázala v tomtéž souboru dvojnásobek pozitivních případů (8 pacientů, tj. 15,7 %). NGS je považováno za nejspolehlivější metodu. Ta potvrdila pozitivitu u čtyř z pěti pozitivních pacientů podle metody IHC (a současně negativních FISH). Dva nemocní FISH negativní, ale IHC a NGS pozitivní byli léčeni crizotinibem s dobou do progrese (PFS) 18 a 6 měsíců.

Podle výsledků NGS lze odvodit, že FISH má 42,9% senzitivitu a 97,7% specificitu, zatímco IHC vykazuje 100% senzitivitu a 97,7% specificitu.

Ze zjištěných dat autoři vyvozují, že FISH není dostatečně citlivou metodou detekce fúze/translokace genu EML4‑ALK, čímž vylučuje z cílené léčby zaměřené na mutace ALK určitý podíl pacientů, kteří by z této terapie profitovali. Proto by měla být IHC screeningovou metodou pro fúze/translokace u EML4‑ALK a ve sporných případech by mělo být použito NGS. Povzbudivým příkladem je léčebná odpověď na crizotinib u dvou pacientů s negativním výsledkem FISH, ale pozitivní IHC (potvrzené NGS).

Mutace u plicního karcinomu a jejich význam

Plicní karcinom je ze všech nádorů nejčastější příčinou úmrtí, a to z celosvětového hlediska. V posledním desetiletí se zásadním způsobem změnil léčebný režim plicního karcinomu, přičemž způsob terapie se odvíjí od molekulární charakteristiky nádoru. Více než 20 % nemocných je léčeno cílenou léčbou, která je zaměřena na některou ze specifických řídících mutací. Nejčastějšími léčebnými cíli jsou mutace genů EGFR (10 až 30 %), EML4‑ALK (3 až 7 %), HER2 (2 až 5 %), BRAF (1 až 3 %), ROS 1 (1 %) a RET (1 %).

Druhou nejčastější mutací je fúze/transpozice EML4‑ALK. ALK (anaplastic lymphoma kinase) je genem pro receptor tyrosinkinázy, který je exprimován jen v nervových buňkách, v jiných nenádorových buňkách přítomen není. Mutovaný protein však byl nalezen v mnoha nádorových buňkách, například v neuroblastomu, anaplastickém velkobuněčném lymfomu a v zánětlivých myofibroblastických nádorech.

Z literárních údajů vyplývá, že až 6,7 procenta plicních adenokarcinomů nese tuto unikátní genovou mutaci. EML4‑ALK je chimérický gen, který vzniká z EML4 (echinoderm microtubule‑associated protein‑like 4) a ALK. Tato fúze genů vyústí v konstitutivní aktivaci tyrosinkinázy. Nekontrolovaný růst, dělení a přežívání nádorových buněk jsou způsobeny právě aktivitou této kinázy. Pacienti s nádory nesoucími tuto mutaci jsou především mladší muži, nekuřáci nebo bývalí mírní kuřáci.

Podle Mezinárodní asociace pro výzkum plicního karcinomu (IASLC, International Association for Lung Cancer) má být molekulární testování ALK provedeno pro výběr pacientů vhodných pro cílenou léčbu u všech pokročilých adenokarcinomů. Prevalence fúze/translokace EML4‑ALK je u neselektovaných nemalobuněčných plicních karcinomů v průměru 3,4 % (rozmezí 1,6 % až 11,7 %), u adenokarcinomů pak 4,5 % (2,4 až 16,1 %).

ALK inhibitory vykazují více než 60% léčebnou odpověď. To je dostatečným důvodem, proč provádět molekulární testování. Dosavadní doporučení dávala přednost FISH, která byla považována za zlatý standard. Klinická zkušenost autorů však prokazuje, že pouhý negativní výsledek FISH není spolehlivým prediktorem neúčinnosti léčby zaměřené na mutace ALK, významnějším markerem účinnosti cílené terapie je pozitivita testu IHC, protože nemocní s negativitou FISH a pozitivitou IHC profitují z cílené léčby.

Výsledky studie

Padesát jedna vzorků histologicky ověřených pokročilých plicních adenokarcinomů (stadium IV) bylo podrobeno vyšetření. Věkový průměr nemocných byl 63,6 roku (v rozmezí 41 až 90 let). Histologický průkaz byl stanoven na základě morfologického vzhledu a standardních imunohistochemických markerů (tyreoidální transkripční faktor 1, cytokeratin 20 a 7).

FISH a IHC analýza

Ze zkoumaného souboru 51 vzorků byly čtyři pozitivní v analýze FISH a osm bylo pozitivních v analýze IHC. Ve třech případech šlo o shodné pozitivní výsledky v obou analýzách. Jeden vzorek byl pozitivní v analýze FISH a negativní v IHC, pět bylo pozitivních v IHC a negativních ve FISH. Těchto šest vzorků s rozdílnými výsledky bylo dále zkoumáno.

NGS analýza

Čtyři z pěti vzorků, které byly podle FISH negativní a podle IHC pozitivní, vykazovaly v analýze NGS fúzi/translokaci EML4‑ALK. Jeden pozitivní ve FISH a negativní v IHC nenesl mutaci EML4‑ALK. Z toho vyplývá, že v této kohortě se nalézala fúze/translokace EML4‑ALK v 13,7 %, nikoli v 7,8 %, jak naznačovala analýza FISH (viz tabulku 1). Charakteristiku souboru znázorňuje tabulka 2 a tabulka 3 shrnuje přesnost FISH a IHC analýzy, přičemž za zlatý standard byla vzata metoda NGS.

Odpověď na léčbu crizotinibem

Jen dva pacienti s rozpornými výsledky byli léčeni crizotinibem: u jednoho činila doba do progrese 18 měsíců, u druhého pacienta bylo dosaženo stabilizace onemocnění.

Výjimečnost studie

Tato práce referuje o první studii, v níž bylo za zlatý standard diagnostiky fúze/translokace ALK použito NGS. Dále tato studie naznačuje, že IHC je citlivější metodou průkazu fúze/translokace ALK než metoda FISH, takže umožní diagnostiku všech pacientů, kteří mohou profitovat z cílené léčby a kteří by při použití FISH zůstali nediagnostikováni. IHC je přitom rychlejší i levnější metodou. FISH analýza není schopna postihnout všechny varianty fúze/translokace EML4‑ALK.

Toto pozorování je v souladu s již dříve publikovanými studiemi, z nichž na tomto místě citujeme studii, v níž bylo sledováno 1 070 pacientů s plicním adenokarcinomem, kteří byli vyšetření NGS. Z nich mělo 47 fúzi/translokaci ALK (4,4 %). Dvacet osm pacientů bylo vyšetřeno také FISH. Devět z nich bylo negativních (32 %) a 19 pozitivních. Pět z FISH negativních pacientů, kteří však vykázali pozitivitu NGS, mělo dobrou léčebnou odpověď na crizotinib. Z pohledu dobré odpovědi na cílenou léčbu zaměřenou na ALK u FISH negativních, ale NGS pozitivních pacientů je nutné přehodnotit doporučení FISH analýzy jako zlatého standardu diagnostiky stavu ALK u plicního karcinomu.

Detekce fúze/translokace ALK u nemalobuněčného plicního karcinomu je klíčová pro volbu správné cílené terapie, protože tato mutace je pozitivním prediktorem účinnosti léčby crizotinibem, ceritinibem nebo alectinibem. IHC představuje velmi senzitivní a spolehlivou metodu, protože používaná králičí monoklonální protilátka D5F3 má v průkazu fúze/translokace ALK 100% senzitivitu a 97,7% specificitu.

Na podporu tvrzení autorů této studie by bylo vhodné provést velkou prospektivní studii o účinnosti cílené léčby u plicního karcinomu s IHC pozitivitou fúze/translokace ALK. Autoři se odvolávají na zkušenosti a podobnost s HER2 pozitivitou u pacientek s karcinomem prsu.

Závěr

Detekce fúze/translokace EML4‑ALK na základě analýzy FISH může vést k značnému počtu falešně negativních výsledků, a tím pádem část pacientů, kteří by profitovali z cílené léčby, jsou z této terapie vyloučeni. Pro screening stavu EML4‑ALK je lépe použít imunohistochemickou analýzu a v nejasných případech sekvenování nové generace.

Zdroj: Medical Tribune