Dobrodružství současné genetiky očima jednoho z jejích zakladatelů

Genetika v posledních desetiletích dosáhla neuvěřitelných úspěchů. Od základů o monogenně podmíněné dědičnosti položených G. J. Mendelem (60. léta 19. století) tato věda v třetím tisíciletí přinesla průlomové poznatky i techniky, například byl přečten lidský genom a genová terapie není snem, ale realitou. Jak vidí genetické pokroky jeden z odborníků, kteří se významně zasloužili o rozvoj genetiky v Česku? Pro čtenáře Medicíny po promoci exkluzivně odpovídá docent MUDr. Milan Macek, CSc., který stál u zrodu Ústavu biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol v roce 1961 (tenkrát pod názvem Ústav výzkumu vývoje dítěte). Tento vynikající vědec, organizátor a učitel oslavil v červenci 2023 úctyhodné 91. narozeniny.

• Pane docente, v šedesátých letech minulého století jste se věnoval problematice viru Epsteina–Barrové (EBV) a jeho vlivu na stabilitu lidského genomu a s tím spojeného rizika vzniku nádorů. V posledních letech se EBV zase vztahuje k autoimunitním onemocněním, konkrétně k roztroušené skleróze.

Mé výsledky byly potvrzeny publikacemi dalších studií, které prokázaly asociaci EBV se vznikem lymfomů, karcinomu nosohltanu, Kaposiho sarkomu. Nádorová reaktivace EBV byla vyvolána mutací MTHFR genu s následnou poruchou syntézy kyseliny listové, s deficiencí methioninu pro metylaci DNA k regulaci genové exprese nebo stravou s nedostatečným množstvím kyseliny listové, vitaminů B₆, B₁₂, C, D, E, cesia a zinku. Na reaktivaci EBV se však podílí i chronický pracovní či psychický stres, nezdravý životní styl, tak jako jiné genotoxické epigenetické faktory zevního prostředí, které vyvolávají hypoxii buněk, ROS syndrom, a tím instabilitu DNA, chromozomů. To je pak příčinou závažných poruch prenatálního a postnatálního vývoje a zvýšeného rizika vzniku nádorů. EBV, tak jako jiné viry, může proto vyvolat epigenetickým účinkem chronický zánět buněk CNS s následnou autoimunitní odpovědí u lidí s genetickou dispozicí roztroušenou sklerózu. Virové infekce patří proto k důležitým epigenetickým faktorům.

• Souhlasíte s tvrzením, že na zdraví lidské populace se podílejí genom člověka a epigenetické vlivy zevního prostředí, utváření imunitního systému a genom střevních mikrobiálních kmenů?

Z nejnovějších poznatků potvrzených výsledky molekulárně genetických studií jednoznačně vyplývá, že tento závěr je správný. Imunologická ochrana je rovněž klíčovou součástí našeho genomu. Tyto poznatky odstranily dřívější rozpory mezi mendelismem, který neuznával dědičnost získaných znaků, a neolamarckismem, který zastával lysenkismus popírající obecnou platnost Mendelem objevených zákonů dědičnosti. Pokrok molekulárně genetické diagnostiky prokázal možnost dědičnosti získaných znaků a epigenetického negativního/pozitivního ovlivnění genové aktivity. Uvedené výsledky výzkumu proto umožnily rozvíjet také diagnostiku, prevenci a léčbu následků škodlivých epigenetických faktorů, které významně ohrožují normální prenatální a postnatální vývoj, a rovněž tak chránit a posilovat stabilitu genomu, snižovat tak rizika vzniku nádorů a předčasného stárnutí bez rizik a velkých finančních nákladů.

• Co pro lékařství znamená sekvenace celého genomu? Budeme kdy umět aplikovat toto poznání v praxi?

Cesta k dosažení tohoto cíle využitím celogenomového sekvenování je možná, ale v dohledné době není reálné jeho klinické využití, protože je zatím nákladné a velmi náročné na interpretaci pro obrovskou variabilitu a počet genů a jejich variant.

• Fascinuje mne, že známých 20 000 genů kóduje statisíce transkriptomů, miliony proteomů a nevyčíslitelné množství metabolomů.

Pokusím se odhadnout perspektivy, které tento pokrok přinese dalšímu rozvoji a klinickému využití lékařské genetiky. Nastupující celogenomové sekvenování genů (WGS) zvýší diagnostickou úspěšnost současného sekvenování exomu (WES; zahrnující zhruba 20 000 patogeneticky významných genů kódujících proteiny) o ne více než o 5 %. Celková diagnostická úspěšnost se v současné době pohybuje kolem 40–50 % podle dané diagnostické skupiny genetických onemocnění.

• Známe rodinu, kde jeden sourozenec čeká na transplantaci srdce pro dilatační kardiomyopatii na podkladě patogeneticky významné mutace, zatímco jeho bratr s touto mutací žije bez problémů i v 60 letech.

To ukazuje, že naši genetickou zátěž lze plně odhalit až s diagnostikou a vyšetřením transkriptomu, proteomu a metabolomu, k čemuž nás přiblíží celogenomová sekvenace, která rozšíří spektrum patogeneticky významných genů, jejichž mutace jsou příčinou těžkého poškození prenatálního a postnatálního vývoje, včetně nádorů. Stále je co zkoumat, protože principy exprese genů nejsou zcela objasněny.

Celogenomové sekvenování pomůže určit geny zvyšující riziko dispozicí k závažným poruchám vývoje člověka za určitých epigeneticky rizikových podmínek zevního prostředí. Může také identifikovat geneticky podmíněné kognitivní schopnosti, například matematické nadání či kreativitu v různých oborech, což umožní tyto pozitivní vlastnosti rozvíjet. Bude možno určit význam genových variant, jejichž biologický význam je prozatím neznámý, a odlišit je od genů, jejichž genová aktivita je trvale reprimována (potlačena), jak se předpokládá u transpozonů, které určovaly vývoj života od jeho začátku na naší planetě.

Nezapomenu na přednášku proslovenou na jednom genetickém kongresu, kde byl prezentován případ dítěte, jehož tvář byla plochá – bez nosu, jako u žáby. Molekulárně genetické vyšetření prokázalo, že mutace rušila inaktivaci genu, který u žab zajišťuje tento obličejový fenotyp.

• Transpozony se někdy označují jako genetické haraburdí.

Toto hodnocení už neplatí. DNA trans­po­zo­nů se považuje za neaktivní část genomu, avšak retrotranspozony (z ka­te­go­rie transpozonů) mají geno­vou aktivitu stále zachovánu. Podle současných poznatků citlivě reagují na epigenetické vlivy a pomáhají udržovat funkční stabilitu našich genů současně s negativní selekcí genů, jejichž aktivita ztratila biologický význam nebo je funkčně škodlivá. Retrotranspozony aktivují polymorfismy genů, které mohou mít funkční význam při změně epigenetických vlivů, což zaručuje plasticitu našeho genomu a jeho vývojovou adaptaci na měnící se životni prostředí a jeho epigenetické vlivy.

Retrotranspozony také zaručují kontrolu genové aktivity určitých genů, aby začala/skončila v pravý čas a na správném místě k zajištění geneticky určeného normálního vývoje od narození až do konce života. Tak je chráněno naše genetické zdraví proti předčasnému stárnutí.

Zajištění klíčových funkcí organismu, jako je úspěšná reprodukce, je pod kontrolou několika tisíců genů. Díky tomu je v našem genomu obrovské množství vzniklých genových variant s prozatím neurčenou funkcí. Například patogeneticky významných variant je v genu CFTR, zodpovědném za rozvoj cystické fibrózy, známo více než 2 000.

Nové studie proto potvrzují význam retrotranspozonů pro zdokonalení molekulárně genetické diagnostiky chorob, vad a nádorů v důsledku epigenetické alterace jejich genetické aktivity.

• Vraťme se k praktickému významu celogenomové sekvenace.

Celogenomová sekvenace by mohla urychlit také poznání zákonitostí a jejich poruch u syntézy proteinů (proteomu) a jejich konečného využití v metabolismu celého organismu (metabolomu). Zatím využíváme pouze molekulárně genetické vyšetření známého genomu a transkripce (transkriptomu).

• Který objev v genetice považujete za podobně průlomový? Zjištění kvarterní struktury bílkovin, metodu CRISPR, genovou terapii (například cystické fibrózy), o níž jsme ve dvacátém století jenom snili a považovali ji za nedosažitelnou?

Pro lékařskou genetiku je průlomovým objevem genová editace metodou CRISPR‑Cas9, která je základem nejúspěšnější metody genové terapie pro klinické využití podle hesla „vy­střih­ni a přilep“, což vystihuje přesně její princip. Je založena na molekulární charakteristice genové mutace, určení přesné hranice mutovaného genu nebo segmentu s mutací, který je enzymaticky vystřižen. Do vystřižené části je vložen celý nemutovaný specifický gen nebo jeho segment. Tím je zajištěno kódování normálního genového produktu, a tak je možno předejít vývoji monogenně podmíněných vad, chorob, dědičných poruch metabolismu, imunity či nádorů ve všech buněčných systémech, tkáních a orgánech.

• Můžete uvést příklady klinického využití?

V tomto roce byly tyto možnosti potvrzeny úspěšným využitím nejnovější verze metody genové editace u hypertrofické kardiomyopatie, choroby s rizikem fatálního konce pro akutní srdeční selhání. Může pomoci nejen postiženým pacientům, ale i v preklinické fázi jejího vývoje v geneticky rizikových rodinách, kde je prokázána její asociace se specifikou mutací. Metody genové editace jsou v současné době rovněž úspěšně využívány ve vazbě na onkologickou imunoterapii nádorů rezistentních na současnou onkologickou terapii.

Transfer editovaného genu do buněk je spolehlivě zajištěn adenoasociovanými viry, které neškodí buňkám příjemce, neintegrují se do jejich genomu a jsou minimálně imunogenní.

• Genetika již dosáhla další významné mety – genové terapie v klinické praxi.

Ano, v posledních letech byla vyvinuta úspěšná in vivo genová terapie, kdy s využitím adenoasociovaného virového vektoru normálního genu podaného infuzí je dosaženo trvalého léčebného úspěchu. Dokumentují to zkušenosti při léčbě spinální muskulární atrofie u dětí, kterou úspěšně zavedla docentka MUDr. Jana Haberlová, Ph.D., na Dětské neurologické klinice 2. LF UK a FN Motol použitím přípravku Zolgensma.

K perspektivním metodám této genové terapie je řazena kombinace s buněčnou terapií založenou na izolaci somatických buněk pacienta in vitro, které se dediferencují specifickou indukcí do stadia pluripotentních kmenových buněk, do nichž je pomocí adenoasociovaných virů přenesen editovaný gen. Po jejich namnožení se infuzí vrátí pacientovi k úspěšné genové léčbě.

• To už jsme na hranicích zázraku, možná až za nimi.

Úspěšně se léčí hereditární hemoglo­bi­no­pa­tie alogenní transplantací pu­peč­ní­ko­vých kmenových buněk ne­po­sti­že­ných novorozenců (po nutné imunosupresi u nemocného). Variantou této metody pro rodiny s hereditární těžkou, neléčitelnou chorobou je využití preimplantační diagnostiky. Po vyšetření genotypu postiženého dítěte, jeho rodičů – nosičů patologické mutace a HLA systému se vybere k transferu do dělohy embryo se stejným HLA haplotypem bez mutací. Po porodu zdravého novorozence pak transfuze kmenových buněk z pupečníkové krve zachrání život postiženému sourozenci – bez imunosupresivní terapie.

Cílená přímá genová terapie vnáší gen přímo do poškozené tkáně, například do sítnice u dědičných degenerativních poruch sítnice, do mozku u Huntingtonovy choroby nebo do míchy u syndromu těžké neuropatické bolesti. Její klinické využití je u nás připravováno na zvířecím modelu miniprasátek na pracovišti profesora MVDr. Jana Motlika, DrSc., (Ústav živočišné fyziologie a genetiky AVČR).

• A co genová terapie cystické fibrózy?

Nejnovější variantou genové strategie je korekční terapie funkce genového produktu, jak je využita právě v léčbě cystické fibrózy podmíněné nejčastějšími variantami mutací CFTR genu s nejčastější mutací delta F 508. Používá se trojkombinace funkčně korigovaných genových produktů CFTR genu (elexacaftor, trexacaftor, ivacaftor), která prokazatelně zlepšuje plicní funkce, kvalitu života, snižuje riziko exacerbace choroby a koncentrace chloridů v potu postižených dětí, což potvrdily výsledky dosažené profesorem MUDr. Pavlem Dřevínkem, Ph.D., (2. LF UK a FNM Praha) ve spolupráci se zahraničními pracovišti.

Širokému klinickému využití genové terapie brání její mimořádně vysoká cena a nutnost dalšího ověřování ke snížení variability výsledků a interakcí mezi používanými léčebnými přípravky. Dosažené výsledky však jednoznačně prokázaly, že genová terapie umožňuje kauzální léčbu jinak nevyléčitelných těžkých dědičných poruch prenatálního a postnatálního vývoje a monogenních chorob včetně zhoubných nádorů na úrovni somatických buněk.

• Co byste predikoval oboru lékařské genetiky v jejím dalším rozvoji a využití?

Vývoj tohoto nového oboru od roku 1961, kdy jsem byl pověřen vybudováním prvního oficiálního oddělení lékařské genetiky u nás, do současné doby prokázal, že lékařská genetika se stala součástí léčebně preventivní péče našeho zdravotnictví a jedním ze základních lékařských oborů. Dosažená úroveň státních i soukromých genetických pracovišť odpovídá mezinárodní úrovni v zajištění prekoncepční prevence screeningem nejčastějších mutací monogenních chorob, v jejich časné prevenci a léčbě, v prevenci dysfertility, v preimplantační diagnostice monogenních chorob a v chromozomálním vyšetření embryí. Inter­dis­ci­pli­nární spolupráce s našimi a zahraničními pracovišti, včetně grantové podpory s aplikovaným klinicko‑genetickým výzkumem zajišťuje další zdokonalování péče o genetické zdraví na vynikající úrovni.

Podle současných poznatků, potřeb a perspektivního využití v péči o genetické zdraví bude důležité rozvíjet v oblasti lékařské genetiky nové směry důležité k dalšímu zdokonalení genetické léčebně preventivní péče, uvedené v následujícím přehledu:

Zdokonalení prevence a léčby epigeneticky indukované instability DNA ke snížení rizik léčby poruch prenatálního a postnatálního vývoje, včetně nádorů a poruch imunity

• Stabilizace DNA rostlinnými produkty;
• Rozvoj nutrigenomiky a nutrigenetiky;
• Vyšetření a ochrana genomu mikrobů střevního systému;
• Rozvoj farmakogenomiky a farmakogenetiky ke snížení rizik, zvýšení úspěšnosti a individualizaci farmakoterapie podle specifity genových variant pacienta.

Zdokonalení molekulárně genetické diagnostiky

• Zdokonalení stávajících metod ke zvýšení jejich spolehlivosti, snížení časové a ekonomické náročnosti celogenomového sekvenování na úrovni genomu, transkriptomu, včetně transpozonů, k objasnění patogeneze vzácných chorob, nádorů, k cílené prevenci a kauzální terapii;
• Detekce variant zvyšujících dispozici k poruchám vývoje, ale i ke specifickému nadání a vynikající kvalitě kognitivních funkcí.

Příprava, zavádění a využití hmotové spektroskopie k vyšetření proteomu

• Odhalení dalších genů a faktorů ovlivňujících aktivitu genů normálních a patogeneticky významných;
• Upřesnění prognózy, diagnostiky a prevence monogenně a polygenně podmíněných chorob a konečného fenotypu.

Zdokonalování metod genové terapie a buněčné terapie

• Zvyšování úspěšnosti, snižování časové, ekonomické náročnosti a jejích rizik;
• Kombinace s metodami buněčné terapie transplantací kmenových pluripotentních buněk bez mutace.

Zdokonalování obecného a specializovaného genetického poradenství

• Zavádění umělé inteligence k in­te­gra­ci a vyhodnocení kli­nic­ko­‑ge­ne­tic­kých nálezů s výsledky biochemické genetiky, imunogenetiky, celogenomového sekvenování genomu, trans­krip­to­mu a proteomu k určení optimální individualizované genetické prevence, diagnostiky a léčby.