Bakteriální rezistence k antibiotikům a proteolytické enzymy

Bakteriální infekce se stávají v dnešním světě stále závažnějším problémem. Řada mikroorganismů přestává být citlivá k používaným antibiotikům, především původci tzv. nosokomiálních infekcí. Tyto mikroorganismy jsou často nositeli resistence k více druhům antibiotik, a proto je léčba infekcí způsobených těmito mikroorganismy složitá. Jednou z možností, jak na problém reagovat, je potencování účinku antibiotik pomocí proteolytických enzymů.

Mezi významné zástupce resistentních grampozitivních bakterií patří rod Staphylococcus (S. aureus, S. epidermis) s klinicky sledovanými kmeny bakterií Staphylococcus aureus resistentními k methicilinu (MRSA) a vankomycinu (VRSA). Mezi zástupce často resistentních gramnegativních bakterií patří Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii a v neposlední řadě Mycobacterium tuberculosis. Těmito infekcemi jsou nejvíce ohroženi pacienti dlouho upoutaní na lůžko a pacienti na jednotkách intenzivní péče či s oslabenou imunitou. Příčiny vzniku resistence vůči antibiotikům jsou známé – nekontrolované a zbytečné užívání antibiotik, nedodržování dávek a doby užívání v humánní medicíně, použití antibiotik v krmivu hospodářských zvířat. Také samotné schopnosti mikroorganismů přizpůsobit se daným podmínkám jsou unikátní, včetně mechanismů, jimiž si tyto vlastnosti (především bakterie) mohou předávat mezi sebou.

Od resistence mikroorganismů vůči antibiotikům se samozřejmě odvíjí i snaha najít způsoby, jak jí předejít či ji omezit. Kromě velmi důležitého sekundárního problému vzniku mikrobiální resistence je nutné vzít v úvahu i primární negativní toxické působení některých antibiotik na člověka. Tyto důvody samozřejmě vedou ke snaze hledat nové způsoby léčby bakteriálních infekcí, které by např. pomohly dosáhnout vyšších koncentrací antibiotik v cílové tkáni, nebo zvýšeného průniku antibiotik do bakteriálních buněk bez nežádoucího zvyšování jejich dávek. Jednou z možností by pravděpodobně mohlo být použití léků obsahujících proteolytické enzymy, jež by potencovaly stávající účinek antibiotik.

Práce, které prezentovaly zvýšení koncentrací antibiotik v tělních tekutinách i ve tkáních při jejich současné aplikaci s určitými proteolytickými enzymy, byly publikovány již v padesátých a šedesátých letech dvacátého století. Tento farmakologický mechanismus – tzv. efekt vehikula proteolytických enzymů – byl prokázán jak v experimentech na zvířatech, tak i ve studiích se zdravými dobrovolníky. Byl vysvětlován změnou prostupnosti tkání při aplikaci proteolytických enzymů. Při těchto výzkumech byly nejčastěji využívány živočišné proteasy trypsin a chymotrypsin nebo rostlinné proteasy bromelain a papain. V dalších letech přibývala sdělení o zvýšení léčebného efektu antibiotik v kombinaci s jednotlivými proteasami nebo později s kombinovanými enzymovými přípravky při terapii nejrůznějších chorob (např. infekce močových cest, záněty dýchacích cest včetně pneumonií, prostatitidy, adnexitidy a další). V nedávné době bylo i českými autory publikováno zvýšení úspěšnosti léčby urogenitálních chlamydiových infekcí při kombinaci antibiotik se systémovou enzymoterapií (Wobenzym – kombinace pankreatinu, bromelainu, papainu, trypsinu, chymotrypsinu, amylasy, lipasy a rutinu).

Z výše uvedeného zákonitě vyplývají otázky, zda efekt vehikula proteolytických enzymů pouze zvyšuje biodostupnost antibiotik – tedy jejich vstřebávání, zlepšený průnik tkáněmi, a tím i jejich zvýšenou koncentraci v cílové tkáni postižené infekcí –, nebo zda proteolytické enzymy mohou také přímo působit na bakterie. Nejen tyto otázky se snaží řešit výzkum probíhající na našem pracovišti.

V dosud realizovaných experimentech bylo in vitro ověřováno ovlivnění růstu určitých bakteriálních kultur jednak vybranými proteolytickými enzymy samotnými, jednak později i kombinacemi těchto enzymů s antibiotiky. Experimenty se prováděly na kulturách grampozitivních (Staphylococcus aureus) i gramnegativních bakterií (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa). Zkoumal se efekt trypsinu, chymotrypsinu, bromelainu a papainu.

Prvním krokem v experimentech bylo zjistit, jaký vliv na růst bakterií mají samotné enzymy. Ukázalo se, že ani vysoké koncentrace zkoumaných enzymů (5 mg/ml) nemají signifikantní inhibiční vliv na růst bakterií. V další fázi experimentu byly bakterie kultivovány s antibiotiky, na která jsou dané kmeny obvykle citlivé. Např. pro S. aureus byl zvolen vankomycin (VAN) a methicilin (MET), pro E. coli tetracyklin (TET) a pro P. aeruginosa norfloxacin (NOR). Byla stanovena nejnižší koncentrace antibiotika, která inhibovala růst bakterií – minimální inhibiční koncentrace (MIC). Následně byly bakterie kultivovány se stejnými antibiotiky v přítomnosti jednotlivých proteas. Výsledky ukázaly, že při kombinaci antibiotik s enzymy byla MIC antibiotika až 20× (o 95 %) nižší oproti MIC při použití samotného antibiotika.

Např. dvacetinásobného snížení MIC (nižší o 95 %) bylo dosaženo u MET pro S. aureus a u TET pro E. coli, při kombinaci těchto antibiotik s trypsinem nebo chymotrypsinem. U druhé gramnegativní bakterie P. aeruginosa byla MIC antibiotik TET i NOR snížena o 50 % při jejich kombinaci s chymotrypsinem. V případě grampozitivní bakterie S. aureus poklesla MIC VAN o 50 % při kombinaci s trypsinem a o 75 % při kombinaci s chymotrypsinem. Přídavek obou proteas se pozitivně projevil i v případě kombinace s erytromycinem (ERY), kdy samotné antibiotikum v koncentraci 2 μg/ml nemělo na růst S. aureus žádný vliv, zatímco po přídavku proteasy došlo k úplné inhibici růstu bakteriálních buněk.

Obecně se dá konstatovat, že nejčastěji docházelo ke snížení MIC použitých antibiotik při testech s chymotrypsinem, následně za použití trypsinu, a méně s bromelainem a papainem. Důvodem může být fakt, že jednotlivé proteasy mají odlišnou substrátovou specifitu z hlediska aminokyselin, mezi kterými je peptidová vazba štěpena. Nicméně zatím nelze zcela jednoznačně zobecňovat, ani co se týče použití konkrétních proteas, jejich koncentrací v kombinaci s určitými antibiotiky a mikroorganismy.

Ani mechanismus synergického působení námi zkoumaných proteas v kombinaci s antibiotiky, jehož výsledkem bylo významné snížení MIC antibiotik pro bakterie kultivované in vitro, dosud nebyl vysvětlen ani popsán. Lze předpokládat, že by zkoumané proteasy (hydrolasy štěpící peptidovou vazbu) mohly štěpit peptidy bakteriální buněčné stěny, a tím způsobovat její poškození a zvýšení propustnosti pro antibiotika. Tato hypotéza bude dále zkoumána pomocí mikroskopických technik např. transmisní elektronovou mikroskopií, která by mohla ukázat změny povrchu buňky nebo struktury buněčné stěny po působení proteas.

Bc. Tereza Klobásová, Ing. Alice Bímová,
Medical Tribune

Zdroj: Medical Tribune