Bakteriální CRISPR/Cas systém a virulence patogenů

Relativně nedávný objev bakteriálního „imunitního systému“ označovaného jako CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced pallindromic repeats/CRISPR‑associated) přináší do biomedicínského výzkumu dramatické změny na mnoha frontách. Nejnověji pomohl objasnit virulenci některých bakteriálních patogenů.

Obranný systém prokaryotů

Pomocí CRISPR/Cas systému se bakterie brání bakteriofágům a plasmidům exogenního původu. Pokud bakterie přežila atak fágu či se zbavila cizího plastidu, vypořádá se s nimi napodruhé mnohem snáze a získá proti nim „imunitu“. Bakterie si ji zajistí tak, že využije fragmenty fágové či plasmidové DNA tvořené 30 až 60 bazemi, které vsune do své vlastní dědičné informace. Fragmenty jsou navzájem odděleny pravidelně se opakujícími palindromickými sekvencemi a vytvářejí CRISPR. CRISPR se vyskytují na více místech bakteriálního genomu a mohou obsahovat až stovky fragmentů fágové či plasmidové DNA.

Ke CRISPR přiléhá sekvence kódující nukleázy Cas. Pokud se do bakterie s příslušným CRISPR/Cas dostanou sekvence DNA pocházející z bakteriofágu či exogenního plasmidu, začne bakterie podle sekvencí CRISPR syntetizovat dlouhou molekulu RNA. Tato dlouhá RNA je následně rozdělena na krátké řetězce RNA tvořené zhruba 60 bazemi. Každá z těchto krátkých RNA se spojí s proteinem endonukleázy Cas a vytvoří tak komplex, který krátká sekvence RNA na principu komplementarity naváže na zcela specifickou cílovou sekvenci plasmidové nebo bakteriofágové DNA. Endonukleáza Cas v tomto místě řetězce DNA štípe. Tak je zajištěna zcela specifická destrukce cizorodé DNA v bakteriální buňce. O významu CRISPR/Cas systému svědčí skutečnost, že byl odhalen u 40 % bakterií a u 90 % archeí. Bakterie a archea mohou šířit sekvence pro CRISPR/Cas systém horizontálním přenosem, což napomáhá šíření bakteriální imunity proti virům i exogenním plasmidům mezi různými druhy prokaryotních organismů.

Využití v genovém inženýrství

Hned několik týmů využilo CRISPR/Cas systém pro konstrukci komplexu nukleázy Cas se sekvencí RNA komplementární k sekvencím, jež je zapotřebí v cílovém organismu modifikovat pro potřeby genového inženýrství. Tento systém dovoluje vysoce efektivní a přísně specifický zásah do genomu nejen bakterií, ale také živočichů včetně člověka. Vyblokování genu nebo vnesení nové sekvence do genomu je možné adresovat na jedno jediné, pečlivě vybrané místo genomu. Prakticky tak lze vyloučit riziko inzerčních mutací, které tradiční techniky genového inženýrství provázely od jejich zrodu.

Pro účely zásahů do genomu zacílených na jediné přesně určené místo se už delší dobu používaly systémy založené na komplexu tvořeném několika proteinovými motivy tzv. zinkových prstů a nukleáz. Ty později nahradil systém TALEN, kde se endonukleáza pojí s proteiny odvozenými od transkripčních efektorů bakterií Xanthomonas. Oba systémy byly náročné na výrobu, protože k vyhledání specifické sekvence pro akci endonukleázy bylo zapotřebí proteinů. Tyto proteiny nebyly navíc zcela specifické a někdy zacílily akci nukleázy na podobnou, avšak necílovou sekvenci.

Systém pro cílené zásahy do genomu založený na principech CRISPR/Cas je na výrobu jednodušší, lacinější a jeho specificita je stoprocentní. Stačí, aby se sekvence lišila od cílové sekvence jedinou bazí, a RNA z komplexu se na ni nenaváže. Nedávno se podařilo pomocí systému CRISPR/Cas jednorázově vyřadit na myším modelu z činnosti pět různých genů. Systém je možné využít i pro homologní rekombinace. To z něj dělá dokonalý nástroj pro genové terapie. Nabízí se například pro cílené narušení receptoru CC R5 na povrchu leukocytů u HIV pozitivních pacientů. Pokud nemají leukocyty funkční tento receptor, jsou odolné vůči virům HIV1.

CRISPR/Cas zvyšuje virulenci bakterií

Nejnovější výzkum týmu amerických vědců z Emory University vedeného Timothym Sampsonem ukazuje, že C RISPR/Cas systém má velký význam pro virulenci patogenních bakterií. Už první studie, jež mapovaly rozšíření CRISPR/Cas systému mezi prokaryoty, odhalila překvapivě vysoký výskyt tohoto obranného mechanismu u patogenních bakterií. Zdá se, že to nebyla náhoda.

V roce 2011 byl přečten genom bakterie Franciscella novicida, jež je blízce příbuzná původci tularémie. V genomu F. novicida byly odhaleny sekvence C RISPR/Cas, jimž byly zpočátku přisuzovány ochranné role proti cizorodým sekvencím. Nejnovější výzkum však odhalil, že bakterie využívá systém C RISPR/Cas k řízení svých vlastních genů a zajišťuje si tak toleranci svého hostitele.

F. novicida je mnohem méně virulentní než původce tularémie F. tularensis, je proto využívána jako modelový mikroorganismus pro studium životního cyklu mnohem závažnějších intracelulárních patogenů. F. novicida dokáže uniknout celé řadě hostitelových obranných mechanismů. Do buněk se dostává přes fagozomy a následně se intenzivně množí v cytosolu. Tato bakterie není například rozeznána řadou buněčných receptorů hostitele včetně Toll‑like receptoru 2 (TLR2), jenž identifikuje bakteriální lipoproteiny. Tím, že F. novicida obejde aktivaci TLR2, může proniknout do cytosolu hostitelské buňky bez toho, že by byly spuštěny mechanismy zánětu. F. novicida tohoto „utajení“ dosahuje potlačením exprese svého genu pro bakteriální lipoprotein, jenž je označován FTN_1103.

Potlačení exprese vlastních genů

Sampson a jeho spolupracovníci publikovali v časopisu Nature přesvědčivé důkazy o tom, že k potlačení exprese genu FTN_1103 využívá bakterie F. novicida systém CRISPR/Cas. V tomto případě nejsou sekvence RNA přepsané podle CRISPR a napojené na nukleázu Cas namířeny proti DNA viru či exogenního plasmidu, ale proti RNA přepsané podle genu FTN_1103 pro bakteriální lipoprotein. Díky potlačení exprese svého genu pro bakteriální lipoprotein se stává F. novicida méně nápadnou pro obranné mechanismy hostitele a zvyšuje se její virulence.

Objev Sampsonova týmu je prvním důkazem o tom, že prokaryotické organismy využívají systém CRISPR/Cas i k regulaci své vlastní dědičné informace, a zároveň i prvním důkazem, že takto vyvolaná změna exprese napomáhá patogennímu mikroorganismu k překonání některých složek vrozené imunity a ke zvýšení virulence. Je téměř jisté, že budou odhaleny další příklady uplatnění systému CRISPR/Cas u patogenů.

Z medicínského hlediska je jistě významná možnost horizontálního transferu komponent systému CRISPR/Cas, protože pro člověka nebezpečné vlastnosti by tak mohly získávat i další patogenní bakterie. Zároveň však představuje odhalený mechanismus cílovou strukturu pro vývoj léků, jež by zabránily patogenu obcházet hostitelovy obranné mechanismy.

Zdroj: Medical Tribune