Azacytidin v nádorových buňkách ovlivňuje geny s protinádorovým účinkem
Přípravek Vidaza (azacytidin) se v České republice využívá již bezmála dva roky jako lék první volby pro pacienty s myelodysplastickým syndromem (MDS) ve vyšším riziku onemocnění (vysoké a velmi vysoké riziko podle IPSS‑R) a také u pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML). Azacytidin syntetizovali v polovině 60. let českoslovenští vědci z ČSAV (Pískala et al., 1964), aby u něj – jakožto analogu jedné z bází DNA – testovali potenciální cytostatický účinek a jeho případné využití v terapii maligních onemocnění. K tomu ovšem tehdy kvůli zjištěným negativním účinkům azacytidinu nedošlo. To se v současnosti změnilo, ale přes nadějný vliv azacytidinu u hematologických malignit není jeho molekulární působení zcela objasněno. Právě vyšlá práce (Dluhošová et al., 2014) z laboratoře 1. LF UK v Praze posouvá vědomosti o azacytidinu o krok dál.
Azacytidin v klinické praxi u MDS
Do středu zájmu vědců a lékařů se azacytidin vrátil v 80. a 90. letech, kdy se začala zkoumat jeho schopnost indukovat v nízkých koncentracích demetylaci buněčné DNA. Této vlastnosti se využívá při léčbě pacientů s MDS a u některých skupin pacientů s AML, u nichž byla popsána aberantně zvýšená metylace DNA v nádorových buňkách. Klinické studie prokázaly, že terapie azacytidinem vede k prodloužení doby celkového přežití léčených pacientů. V klinické randomizované studii AZA‑001 fáze III na 358 pacientech s MDS s vyšším rizikem a AML dosáhlo celkového přežití po dvou letech při léčbě azacytidinem 50,8 % pacientů ve srovnání s 26,2 % pacientů zařazených do konvenčních léčebných režimů (Fenaux et al., 2009). U 113 pacientů s AML zahrnutých do této studie se dvou let při léčbě s azacytidinem dožilo 50 % pacientů ve srovnání s 16 % pacientů léčených konvenčně (Fenaux et al., 2010). Probíhající klinická studie fáze III AZA‑AML‑001 na 480 pacientech s primární i sekundární AML si klade za cíl tyto výsledky ověřit.
Dobrých výsledků dosahuje azacytidinová terapie u pacientů s MDS a AML i v České republice. Z 92 hodnotitelných pacientů s MDS ve vyšším riziku, resp. s AML (z toho 28 pacientů s AML < 30 % blastů a 7 pacientů s AML > 30 % blastů), léčených mezi říjnem 2008 a červnem 2012 v České republice, jich 67,8 % dosáhlo celkového přežití v jednom roce s mediánem celkové délky života 16,4 měsíce (Jonášová et al., 2013).
Pozitivní výsledky azacytidinu v klinické praxi u pacientů s MDS a AML vedou k jeho vzrůstajícímu využití jako perspektivního terapeutika těchto malignit. Navzdory těmto úspěchům však při terapii s azacytidinem přetrvává řada problémů, zejména skutečnost, že mnozí pacienti s MDS na azacytidin neodpovídají a u dalších nemocných časem propuká vůči jeho účinkům rezistence. Pacienti s MDS, u kterých dojde k selhání léčby azacytidinem, mívají špatnou prognózu s mediánem doby celkového přežití 5,6 měsíce a patnáctiprocentní pravděpodobností dožití dvou let (Prébet et al., 2011). Ještě horší prognózu po selhání léčby s azacytidinem mají pacienti s AML. Z těchto důvodů i nadále probíhá intenzivní výzkum zaměřený na porozumění molekulárním a buněčným mechanismům účinku azacytidinu, který by tyto výrazné rozdíly v odpovědích jednotlivých pacientů s MDS a AML objasnil.
Epigenetika – mechanismy řízení přepisu DNA – u MDS
MDS představuje skupinu klonálních onemocnění kostní dřeně s poruchou buněčné diferenciace a častou progresí do AML. Onemocnění se vyznačuje vysokou variabilitou svého klinického projevu. Tak jako u mnoha jiných klonálních malignit dochází i v buňkách pacientů s MDS k hromadění velkého počtu mutací různých genů. Význam konkrétních mutací pro patogenezi onemocnění ale zůstává nejasný. Vedle toho je známo, že pro MDS je typická aberantně zvýšená metylace mnoha úseků DNA, o níž se obecně soudí, že vede k potlačení genové exprese. Teprve využití metody hlubokého sekvenování a celogenomového mapování oblastí metylované DNA v několika posledních letech umožnilo získat komplexnější představu o změnách u MDS a AML na genetické a epigenetické úrovni (Welch et al., 2012; Bejar et al., 2011). Nové výsledky ukázaly zajímavou souvislost mezi přítomností aberantní metylace DNA a častými mutacemi v genech, které se účastní jejího odstraňování, a dále odhalily mutace a epigenetické utlumení transkripčních faktorů klíčových pro myeloidní diferenciaci.
Metylace DNA patří mezi epigenetické mechanismy regulace genové exprese, které působí na úrovni prostorové struktury vlákna DNA. Mezi molekuly účastnící se tvorby prostorových struktur vlákna DNA patří faktor CTCF, který v závislosti na konkrétním místě svého působení vytváří spojení nebo naopak brání komunikaci vzdálených oblastí DNA. Jiný epigenetický faktor SMARCA5 pak rozmotává nebo naopak kondenzuje vlákno DNA (jeho aktivitu si lze představit jako posouvání korálků na niti), což ovlivňuje přístup transkripčních faktorů na DNA a její přepis. Představujeme si, že CTCF a SMARCA5 společně skenují celou sekvenci DNA a podle určitých kritérií (především metylace DNA) mění její strukturní vlastnosti tak, že umožňují nebo naopak znemožňují přepis genových produktů, buněčné dělení či udržení buněčné integrity.
Krvetvorba, to jsou početně zanedbatelné kmenové buňky produkující v procesu diferenciace obrovská kvanta krvinek. Hlavním regulátorem tohoto úžasného jevu je transkripční faktor vážící se na purinové báze DNA a označovaný jako PU.1. Předchozí práce naší laboratoře naznačila existenci vztahu mezi hladinou exprese tumor‑supresorového a prodiferenciačního transkripčního faktoru PU.1 a odpovědí pacientů s MDS na léčbu azacytidinem. Pacienti s vyšší hladinou PU.1 dosahovali zhruba trojnásobného mediánu celkového přežití na léčbě azacytidinem ve srovnání s pacienty s nízkou hladinou PU.1 v nádorových blastech. Prokázali jsme, že azacytidin je schopen demetylovat klíčovou regulační oblast genu PU.1 (URE) a obnovit tak přepis tohoto důležitého genu (Čuřík et al., 2012).
Nádorové buňky u MDS mohou uniknout účinkům azacytidinu
Nová práce z laboratoře Tomáše Stopky vycházející v odborném časopise PLOS ONE (Dluhošová et al., 2014) ukazuje, že v buňkách MDS dochází působením azacytidinu k demetylaci DNA na více regulačních oblastech genu PU.1. Na modelu buněčné linie blastů AML odvozených z MDS i na primárních buňkách kostní dřeně MDS pacientů je patrné, že azacytidin vedle regulační oblasti URE demetyluje také přilehlou oblast „Enhanceru ‑14,4“, která se rovněž účastní řízení přepisu PU.1 (viz obrázek). Na nově demetylované regulační oblasti se však může vázat i komplex epigenetických faktorů CTCF a SMARCA5, který inhibuje expresi PU.1. Tím dochází ke stavu, kdy azacytidin může za určitých okolností bránit krvetvorným procesům. Je pravděpodobné, že to je i jedním z mechanismů krvetvorných defektů u některých pacientů léčených azacytidinem (viz obrázek).
Z výše uvedeného vyplývá, že demetylace DNA azacytidinem by mohla na dvou regulačních oblastech genu PU.1 působit vzájemně protichůdným účinkem – na oblasti URE aktivačním a na oblasti „Enhanceru ‑14,4“ inhibičním. Dále z uvedené práce vyplývá, že v diferencujících myeloidních buňkách zdravých dárců k vazbě komplexu CTCF‑SMARCA5 na oblast „Enhanceru ‑14,4“ nedochází. Z toho plyne, že azacytidin v blastech AML nenavozuje stav přítomný v normálně diferencujících buňkách, nebo naopak, normální krevní buňky reagují na azacytidin zcela jinak než leukemické blasty. Pokud by se ukázalo, že vazba komplexu CTCF‑ ‑SMARCA5 na demetylovanou DNA v oblasti „Enhanceru ‑14,4“ představuje děj specifický pro leukemické buňky v MDS, resp. MDS/AML, nabízelo by to jedno z možných vysvětlení rezistence některých pacientů na azacytidin, který u nich není schopen navodit nepostradatelný přepis genu PU.1, jenž je spojen s plnohodnotným myeloidním vývojem ve zdravé kostní dřeni.
Zdroj: Medical Tribune