Amplifikace otáčivou kružnicí pro rychlou detekci mutace genu
Mgr. Martin Bartošík, Ph.D., z Masarykova onkologického ústavu v Brně a Národního ústavu pro výzkum rakoviny (NÚVR) spolupublikoval v roce 2023 v prestižním mezinárodním časopise Sensors and Actuators B: Chemical výsledky výzkumu týkajícího se vývoje elektrochemické metody pro rychlou detekci mutace V600E v genu BRAF, která je založena na jiném principu než standardně užívané polymerázové řetězové reakci (polymerase chain reaction, PCR).
Mutace V600E v genu BRAF je významným prognostickým a prediktivním biomarkerem v léčbě vybraných zhoubných nádorů, zejména melanomu nebo kolorektálního karcinomu. Na tuto mutaci lze následně cílit léčbu selektivními inhibitory kinázy BRAF V600E.
Tzv. amplifikace otáčivou kružnicí (rolling circle amplification, RCA) je využívána zejména v technice PLA (z angl. proximity ligation assay) pro analýzu interakcí protein–protein. Existují ovšem i varianty vhodné pro analýzu nukleových kyselin, jejichž společným principem je současné navázání cílové nukleové kyseliny na oba konce speciálně navržené sondy DNA (tzv. padlock sondy) pomocí hybridizace, čímž se tyto konce přiblíží k sobě. Díky tomu může proběhnout ligace (tj. kovalentní spojení) obou konců padlock sondy pomocí ligázy a vznik kovalentně uzavřené kruhové sondy. Ta následně slouží jako templát pro speciální polymerázu, která kruhovou DNA mnohonásobně amplifikuje, a to i při nízkých teplotách. Jelikož i záměna jediného nukleotidu brání ligaci, je tato metoda vysoce specifická.
Amplifikovaný produkt je pro ještě další zvýšení specificity následně hybridizován na magnetických kuličkách pomocí komplementární sondy LNA (tzv. uzamčené nukleové kyseliny, locked nucleic acid) a elektrochemicky detekován na elektrodových čipech. Jedná se o první elektrochemickou technologii založenou na metodě RCA pro analýzu mutace BRAF v duálním formátu (současné stanovení nemutovaného/mutovaného V600E) bez použití PCR nebo sofistikované instrumentace, která již byla ověřena nejen na buněčných liniích, ale také na nádorových buňkách pacientů s melanomem a kolorektálním karcinomem. Její vývoj probíhal ve spolupráci se španělskou laboratoří při Universidad Complutense de Madrid – a tato spolupráce se díky NÚVR nadále úspěšně prohlubuje.